本发明专利技术属于生物技术领域，更具体地，本发明专利技术公开了一种重组抗HER2/PS双特异性抗体、其制备方法和应用。本发明专利技术的抗HER2/PS双特异性抗体既能与HER2结合，还能与PS结合，本发明专利技术的双特异性抗体具有良好的抗肿瘤效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及抗体领域，更具体地，本专利技术公开了一种重组双特异性抗体、其制备方 法和其在抗实体瘤上的作用。
技术介绍
细胞凋亡是机体中的一个受严格调控的程序，高效清除凋亡细胞是免疫耐受的基 础。在凋亡过程中，处于正常细胞的细胞膜内表层的磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine， PS)翻转至细胞膜外表层。M2型巨噬细胞利用细胞表面PS受体识别此信号从而吞噬 凋亡小体，同时，释放肿瘤生长因子（tumor growth factor，TGF)-0,白细胞介素-10 (interlukinlO, IL-10)等炎症抑制因子介导一系列免疫抑制程序。近年来，人们发现肿瘤血管上皮细胞、肿 瘤来源的外来体以及处于肿瘤微环境中的肿瘤细胞也存在PS的外翻，并且这种外翻在接 受化疗或放疗后更加明显。这些PS外翻的肿瘤细胞同样通过增强肿瘤微环境中的巨噬细 胞向具有免疫抑制功能的M2型巨噬细胞分化，抑制具有强大细胞杀伤能力的Ml型巨噬细 胞生成从而促进肿瘤生长。 研究表明，特异性针对人PS的单克隆抗体Bavituximab (美国Peregrine公开开发，CAS NO. 648904-28-3)通过多种不同的机制抑制了肿瘤的生长：1)利用抗体依赖的细胞介导 的毒性作用（antibody dependent cell mediated cytotoxicity, ADCC)直接杀伤表达 PS的肿瘤来源细胞，尤其是肿瘤血管上皮细胞；2)阻断M2型巨噬细胞对PS的识别，抑制 肿瘤微环境中免疫抑制策略的发展从而促进Ml型肿瘤杀伤巨噬细胞的活化，清除肿瘤 细胞。Bavituximab 在与多西他赛 (Docetaxel)联合用药的非小细胞肺癌（non-small-cell lung carcinoma, NSCLC)二期临 床中显示了极好的疗效，相比于多西他赛，中位总生存期提高了 4. 3个月，基于此数据，美 国FDA将其纳入快速通道。同时，在乳腺癌的二线治疗中Bavituximab与多西他赛的联用 将患者中位总生存期从多西他赛单药的11. 4个月提高到21. 7个月。 约20%~25%的乳腺癌患者存在人类表皮生长因子受体2 (human epidermal growth factor，HER2)基因扩增或蛋白过量表达。抗 HER2 单克隆抗体 Trastuzumab (商品名：Herceptin) 从1998年上市至今，一直高居单抗药物销量前五。通过直接杀伤HER2高表达的 乳腺癌细胞，Trastuzumab显著改善肿瘤患者的预后。但是在此过程中，不可避免地由于死细胞和凋亡细胞呈现大 量的细胞表面PS，肿瘤耐受型免疫应答被诱导。因此，构建一个可以同时特异性结合HER2 与PS两个靶点的双特异性抗体，实现在直接杀伤细胞表面HER2或PS阳性的肿瘤细胞的同 时，还抑制随后肿瘤免疫耐受的发生，阻断肿瘤免疫逃逸通路，一直是本领域的技术人员急 待解决的问题。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术的专利技术人进行了大量试验，得到了一个可以同时阻断 HER2与PS两个靶点的双特异性抗体，即本专利技术所述的"重组抗HER2/PS双特异性抗体"，从 而完成了本专利技术。 本专利技术公开了 ： 1. 一种重组抗HER2/PS双特异性抗体，其特征在于所述抗体既能与HER2结合，还 能与PS结合。 2.上述重组抗HER2/PS双特异性抗体，其特征在于，所述重组抗HER2/PS双特异性 抗体可变区氨基酸序列包含抗HER2单克隆抗体的可变区和抗PS单克隆抗体可变区氨基酸 序列。 3.上述重组抗HER2/PS双特异性抗体，所述双特异性抗体重链可变区氨基酸序列 如SEQ ID NO:6所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。 4.本专利技术所提供的重组抗HER2/PS双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗 体重链氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示,轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。 5. -种分离的核酸分子，其编码上述1-4任一所述抗HER2/PS双特异性抗体。优 选地，所述核酸分子重链核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，轻链核苷酸序列如SEQ ID NO:3 所示。 6. -种载体，其含有上述5所述的核酸分子，所述载体可以为pDRl，pcDNA3· 1( + )， pDHFF 及 pCHOl. 0 之一，优选 pCHOl. 0。 7. -种宿主细胞，其含有上述6所述的载体，优选地，所述细胞为真核细胞，更优 选地，所述细胞为哺乳动物细胞，最优选地，所述细胞为中国仓鼠卵巢（Chinese Hamster Ovary, CHO)细胞。 8. -种制备上述抗HER2/PS双特异性抗体的方法，该方法包括： a)在表达条件下，培养上述7所述的宿主细胞，从而表达抗HER2/PS双特异性抗 体； b)分离或纯化a)的抗HER2/PS双特异性抗体。 9.上述抗HER2/PS双特异性抗体制备方法，包括以下步骤： a)构建抗HER2/PS双特异性抗体的重链融合基因和轻链融合基因； b)将上述a)融合基因克隆到载体pCHOl. 0,构建表达载体pCHOl. 0 (anti-HER2/ PS)； 〇)将上述13)的？0101.0(&拉丨-册1?2/^)表达载体转染010细胞，筛选，进行亚克 隆，将筛选得到的高表达克隆进行扩大培养，表达抗HER2/PS双特异性抗体； d)分离或纯化c)所述抗HER2/PS双特异性抗体。 10. -种组合物，含有上述1-4任一所述的抗体和药学上可接受的载体。 11.上述1-4任一所述的抗HER2/PS双特异性抗体或上述10所述组合物在制备抗 肿瘤药物中的用途。 12.上述11所述用途，还包括和其它的抗肿瘤药物联合使用。 本专利技术中，任何合适的载体都可以使用，可以为pDRl，pcDNA3. 1 ( + )，pDHFF及 pCHOl. 0 (如图2)之一,表达载体中包括连接有合适的转录和翻译调节序列的融合DNA序 列。 本专利技术中，可用的宿主细胞为含有上述载体的细胞，可以是真核细胞，如哺乳动物 或昆虫宿主细胞培养系统均可用于本专利技术的融合蛋白的表达，C0S，CH0，NS0, sf9及sf21 等均可适用于本专利技术；也可以为含有上述载体的原核细胞，可以为DH5a，BL21 (DE3)，TGl之 〇 本专利技术中公开的抗HER2/PS双特异性抗体的制备方法为在表达条件下，培养上述 的宿主细胞，从而表达抗HER2/PS双特异性抗体；分离或纯化所述的抗HER2/PS双特异性抗 体。利用上述方法，可以将融合蛋白纯化为基本均一的物质，例如在SDS-PAGE电泳上为单 一条带。 可以利用亲和层析的方法对本专利技术公开的融合蛋白进行分离纯化，根据所利用的 亲和柱的特性，可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变PH等方法洗脱结合在亲和柱上 的融合蛋白多肽。 本专利技术公开的上述抗HER2/PS双特异性抗体是通过以下方法得到的：抗HER2抗体 Trastuzumab(IgGl, κ )的八序列与Vh序列分别通过不同接头短肽（例如：ASTKGP ;TVAAP) 与抗PS抗体Bavituximab (IgGl, κ )的N端相连接。更具体地，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组抗HER2/PS双特异性抗体，其特征在于所述抗体既能与HER2结合，还能与PS结合。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：朱玲巧，张成海，赵杰，郭锦林，李致科，
申请(专利权)人：上海中信国健药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。