羊布鲁氏菌间接ELISA抗体检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及羊布鲁氏菌间接ELISA抗体检测试剂盒。本发明专利技术将提纯的布鲁氏菌脂多糖(LPS)经定量后包被96孔酶标板，以人工免疫健康绵羊制备阳性血清，以健康非免疫绵羊血清作阴性血清，以HRP标记兔抗羊Fc端抗体、底物溶液、终止液、样品稀释液、HRP标记兔抗羊IgG稀释液及20×洗涤液等组分组装而成，用于检测羊血清中的光滑型布鲁氏菌抗体。本发明专利技术在常规提取LPS中，增加了蛋白酶K消化和苯酚抽提步骤，有效提高了LPS纯度；筛选了对山羊和绵羊均具有良好亲和力的单克隆抗体作为酶标二抗。本发明专利技术通过对主要试剂配方的改进和优化，有效控制试剂盒的反应背景，缩短了高通量检测所需的时间。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种动物布鲁氏菌病的诊断方法——羊布鲁氏菌间接ELISA抗体检测试剂盒，属生物制品检测
技术背景布鲁氏菌病(布病)是一种严重威胁人类健康的世界性重要人畜共患病，可感染人、多种家畜和野生动物，主要表现为发热、流产与不育、慢性关节炎及神经损伤等。目前全世界范围内消除该病的主要方法是扑杀与免疫相结合，所以建立快速准确的诊断方法对防治和清除布病非常必要。布鲁氏菌抗体检测中的国际贸易指定试验主要有虎红平板凝集试验(RBT)、补体结合试验(CFT)和酶联免疫吸附试验(ELISA)。荧光偏振试验(FPA)是国际贸易中选择试验。目前我国《布鲁氏菌病防治技术规范》中规定的牛布鲁氏菌抗体检测方法为：先经虎红凝集试验(RBPT)初步检测，再经试管凝集试验(SAT)或补体结合试验确诊。试管凝集试验不仅操作复杂，耗时长，而且也存在特异性不高的问题；补体结合试验是公认的确诊方法，但是试验操作复杂，需有良好的试验设施和训练有素的人员作准确的组分滴定、试剂保存和结果判断。荧光偏振试验(FPA)对实验条件和操作技术要求都较高。ELISA是一种与CFT效果相当的诊断方法，该方法操作方便，灵敏度高，特异性较好，一次可以完成大量样品的检测，既可以作为筛选试验应用于动物群体检疫，还可以作为确诊试验。ELISA不仅可以应用于血清抗体的检测，还可应用于乳样中抗体的检测。牛布鲁氏菌病ELISA检测方法已是国际贸易中指定的检测方法之一，该方法解决了常规方法耗时费力的不足，提高了检测的特异性、敏感性和便捷性。可能由于羊布病在国际上发病率较低等原因，到目前为止，国际上尚无商品化的专门针对羊布病的间接ELISA诊断试剂盒。而我国羊的养殖规模非常大，布病发病率又非常高，因此开发专门针对羊的布病间接ELISA诊断试剂盒有其现实意义。在成功开发了牛布病间接ELISA的基础上，我们又开发成功了羊布病间接ELISA抗体检测试剂盒。通过对单抗制备和筛选、包被抗原、反应条件、结果判断标准等多方面条件的优化，特别是以提取的绵羊IgGFc段作为免疫原，采用绵羊IgG和山羊IgG同时进行单抗筛选，选取对同一浓度山羊IgG和绵羊IgG具有相似反应强度的单抗作为辣根过氧化物酶的标记抗体，使试剂盒在检测山羊血清和绵羊血清时具有同等的敏感性；另外，本专利技术中对阳性血清的效价进行了精确标定，比较理想地解决了羊布鲁氏菌间接ELISA抗体诊断方法中特异性和敏感性问题。本专利技术的内容本专利技术的目的是建立一种羊布鲁氏菌抗体高通量检测技术，其核心是将提纯的布鲁氏菌脂多糖(LPS)经定量后包被96孔酶标板，以人工免疫健康绵羊制备阳性血清，以健康非免疫绵羊血清作阴性血清，以HRP标记鼠抗羊Fc段单抗、底物溶液、终止液、样品稀释液、HRP标记鼠抗羊IgG稀释液及20×洗涤液等组分组装而成，用于检测绵羊和山羊血清中的光滑型布鲁氏菌抗体。本专利技术的技术方案1.一种羊布鲁氏菌间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于该试剂盒主要含有：以制备的布鲁氏菌脂多糖作为包被抗原，以人工免疫健康绵羊制备阳性血清，以采集健康非免疫绵羊血清作阴性血清，以HRP标记鼠抗羊IgGFc抗体、底物溶液、终止液、样品稀释液、HRP标记鼠抗羊IgG稀释液及20×洗涤液等组分组装而成，用于检测绵羊和山羊血清中的光滑型布鲁氏菌抗体。2.本专利技术所述羊布鲁氏菌间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于阳性血清的制备和标定方法是：用布鲁氏菌虎红平板凝集试验、试管凝集试验和补体结合试验对临床表现健康的15月龄成年羊进行检测，筛选布病抗体阴性羊；对筛选的阴性羊用布鲁氏菌参考强毒株M28灭活抗原以5×1010CFU/羊颈部皮下免疫，3个月后双倍剂量加强免疫1次。加强免疫后2周采血，用试管凝集试验测定凝集效价为800IU/ml。静脉放血，分离血清，用羊布病阴性血清与效价为800IU的阳性血清等体积稀释，将其效价调整为400IU/mL，用0.45μm滤器过滤除菌，作为试剂盒中布病阳性血清。3.本专利技术所述羊布鲁氏菌间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于HRP标记鼠抗羊IgGFc抗体是由被命名为抗羊IgGFc段单克隆抗体细胞6F9株制备的，该细胞株已于2016年11月14日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所内中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.13282。4.本专利技术所述羊布鲁氏菌间接ELISA抗体检测试剂盒的应用，其特征在于使用该试剂盒能对山羊和绵羊布鲁氏菌病进行高通量检测。本专利技术具体实施方式1.抗原制备用菌种(羊种布鲁氏菌M28株，B.MelitensisM28)的鉴定。(1)菌落形态菌落边缘整齐、圆润，露滴状，斜光照射，逆光观察微带蓝色乳光。(2)染色形态为球杆菌，单个散在，不形成芽孢和荚膜。大小在0.3～0.6μm之间。革兰氏染色为阴性，柯氏染色为红色。(3)纯粹检验按现行《中国兽药典》(中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一〇年版三部，中国农业出版社，2011，以下称《中国兽药典》)附录进行，应纯粹。(4)特异性检验1)血清学特异性以培养物制成抗原，与光滑型布鲁氏菌阳性血清应出现凝集，与粗糙型血清不出现凝集。2)以M28基因组DNA为模板，使用如下4条引物，能扩增出大小分别为178bp和733bp的特异性PCR条带。Feri：5’-GCGCCGCGAAGAACTTATCAA-3’(序列1)Reri:5’-CGCCATGTTAGCGGCGGTGA-3’(序列2)Fmelitensis:5’-AAATCGCGTCCTTGCTGGTCTGA-3’(序列3)RIS711:5’-TGCCGATCACTTAAGGGCCTTCAT-3’(序列4)PCR反应体系：50μL的反应体系中，含5μL10×Buffer，8μL2.5mMdNTPs，混合引物储存液2μL，Taq酶2U，模板DNA1μL(或挑取菌落少许)。PCR反应程序：95℃5min后，按94℃1min、60℃1.5min、72℃1.5min进行28个循环，最后72℃10min。结果：扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳鉴定，应出现2条特异性PCR条带，大小分别为178bp和733bp(见附图1)。2.包被抗原LPS的提纯和定量(1)菌悬液制备将鉴定合格的B.MelitensisM28株二级种子接种于胰琼脂扁瓶中，37℃培养48小时后，每瓶加入含有0.5％苯酚的生理盐水20ml浸泡菌体表面10min以上，洗下培养物，收集于无菌玻璃瓶中。(2)菌液灭活及灭活检验将收集好的菌悬液加热到80℃，维持120min，待其自然冷却后，存于4℃。对灭活菌液应进行灭活检验。取灭活菌液0.1ml涂布胰琼脂或胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)平板，37℃培养7天，不应无菌生长。(3)LPS的粗提将灭活检验合格的菌悬液以10000g离心20min，收集沉淀。称量并计算菌体湿重，将菌体湿重按1:3(W/W)比例加入灭菌蒸馏水中，充分混匀后，加热到66℃，然后加入66℃预热的90％(V/V)苯酚溶液。在此温度下(66℃)持续搅拌15min，置室温自然冷却后，于4℃10000g离心15min。用一长管吸弃下层棕红色的酚相，将水相用Wha本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种羊布鲁氏菌间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于该试剂盒主要含有：以制备的布鲁氏菌脂多糖作为包被抗原，以人工免疫健康绵羊制备阳性血清，以采集健康非免疫绵羊血清作阴性血清，以HRP标记鼠抗羊IgG Fc抗体、底物溶液、终止液、样品稀释液、HRP标记鼠抗羊IgG稀释液及20×洗涤液等组分组装而成，用于检测绵羊和山羊血清中的光滑型布鲁氏菌抗体。

【技术特征摘要】
1.一种羊布鲁氏菌间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于该试剂盒主要含有：以制备的布鲁氏菌脂多糖作为包被抗原，以人工免疫健康绵羊制备阳性血清，以采集健康非免疫绵羊血清作阴性血清，以HRP标记鼠抗羊IgGFc抗体、底物溶液、终止液、样品稀释液、HRP标记鼠抗羊IgG稀释液及20×洗涤液等组分组装而成，用于检测绵羊和山羊血清中的光滑型布鲁氏菌抗体。2.权利要求1所述羊布鲁氏菌间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于阳性血清的制备和标定方法是：用布鲁氏菌虎红平板凝集试验、试管凝集试验和补体结合试验对临床表现健康的15月龄成年羊进行检测，筛选布病抗体阴性羊；对筛选的阴性羊用布鲁氏菌参考强毒株M28灭活抗原以5×1010CFU/羊颈部皮下免疫，3个月后双倍剂量加强免疫1次。加强免疫...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁家波，冯宇，王芳，朱良全，蒋卉，彭小薇，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：北京;11