一种用于羊新疆巴贝斯虫病检测的间接ELISA方法技术

本发明专利技术公开一种用于检测羊新疆巴贝斯虫病的ELISA诊断试剂盒，包含大肠杆菌表达系统所制备的重组RAP‑1蛋白作为检测血清中抗羊新疆巴贝斯虫特异性抗体的抗原。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于检测羊新疆巴贝斯虫病的ELISA诊断试剂盒，具体涉及大肠杆菌表达系统所制备的重组RAP-1蛋白作为检测血清中抗羊新疆巴贝斯虫特异性抗体的抗原，而建立起的一种间接ELISA方法。
技术介绍
羊巴贝斯虫病(ovineBabesiosis)是由媒介蜱传播的由巴贝斯科巴贝斯属的以绵羊巴贝斯虫(Babesiaovis)，莫氏巴贝斯虫(B.motasi)和粗糙巴贝斯虫(B.crassa)为主要病原因子寄生于绵羊和山羊的红细胞内所引起的疾病的总称。是主要分布在热带和亚热带地区的血液原虫病。临床反应通常以高热，溶血性贫血，黄疸，血红蛋白尿为主要特征，严重时引起死亡。本病危害严重，严重时可引起死亡，给养羊业造成重大经济损失。羊巴贝斯虫在宿主红细胞内进行无性繁殖，有性繁殖发生在传播媒介蜱体内，并通过蜱的叮咬传播到宿主体内，因此巴贝斯虫的分布与其传播媒介-蜱的分布范围相一致。在我国主要感染绵羊和山羊的巴贝斯虫有莫氏巴贝斯虫和新疆巴贝斯虫未定种。阻断裂殖子对红细胞的入侵过程是控制巴贝斯虫感染的关键；裂殖子的表面蛋白或由裂殖子细胞器所分泌的、在入侵过程中发挥作用的蛋白可能作为抗原蛋白或药物靶点，阻断裂殖子入侵宿主红细胞进行无性繁殖被认为是一种具有潜力的防治策略。棒状体相关蛋白(Rhoptry-associatedprotein1,RAP-1)位于顶复门寄生虫裂殖子的棒状体上，是寄生虫与宿主红细胞粘附后由棒状体分泌的与红细胞入侵相关的蛋白。目前常用的分子诊断方法有PCR、RLB、RPA等。虫体宿主体内产生抗体，且抗体可持续存在较长时间，因此血清学诊断是较为实用经济的方法用于巴贝斯虫病的诊断。目前，重组抗原(裂殖子抗原，棒状体相关蛋白和致密颗粒蛋白)已被广泛地用于牛、马和犬巴贝斯虫病的血清学检测。对于羊巴贝斯虫病检测,通过牛巴贝斯虫粗抗原和合成的牛巴贝斯虫抗原(11C5)建立的ELISA方法可用于检测绵羊巴贝斯虫感染后产生的抗体(参见Duzgun,A.,Wright,I.G.,Waltisbuhl,D.J.,Gale,K.R.,Goodger,B.V.,Dargie,J.D.,Alabay,M.,Cerci,H.(1991).AnELISAforthediagnosisofBabesiaovisinfectionutilizingasynthetic,Babesiabovis-derivedantigen.VeterinaryParasitology39,225-231),目前，有些新的重组蛋白被认为可作为候选诊断抗原：绵羊巴贝斯虫分泌抗原1和分泌抗原2用于绵羊巴贝斯虫病的检测,以及BQP35和热休克蛋白90用于中国流行的莫氏巴贝斯虫抗体的检测。基于重组蛋白BQP35通过免疫印迹和ELISA方检测显示莫氏巴贝斯虫的临潭和天祝株有交叉反应,而热休克蛋白90产生非特异性反应。目前为止，2012年关贵全利用裂殖子粗抗原建立了间接ELISA方法用于检测新疆巴贝斯虫未定种，但与牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫有交叉反应。本专利技术利用获得棒状体相关蛋白(RAP-1)序列，克隆表达获得RAP-1重组蛋白，经动物免疫、WesternBlotting和ELISA实验证实，RAP-1重组蛋白均具有较好的免疫原性和反应原性，且特异性好。用RAP-1重组蛋白建立的间接ELISA方法，完全适用于我国羊新疆巴贝斯虫病的血清学检测和流行病学调查。本专利技术利用中国羊巴贝斯虫病的流行虫种-新疆巴贝斯虫未定种的rap-1基因，通过克隆表达，以纯化的RAP-1蛋白作为诊断抗原，采用间接ELISA模式，研制出新疆巴贝斯虫未定种RAP-1抗体检测试剂盒。该法操作简单，耗时短，成本低。本专利技术针对我国畜牧业领域中羊新疆巴贝斯虫病的发病状况确定了判定标准，从而能够有效检测新疆巴贝斯虫感染的绵羊和山羊。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题如上所述的现有技术中，检测新疆巴贝斯虫感染的绵羊和山羊时，存在成本高，耗时长以及特异性低等问题。解决上述技术问题的方法为了解决上述技术问题，本专利技术人经过契而不舍的努力，在不断创造性的重复实验基础上，利用PCR扩增获得棒状体相关蛋白(RAP-1)基因序列，克隆表达获得RAP-1重组蛋白。应用分子生物学技术将其克隆到克隆载体(pGEM-TEasyvector)，再将其亚克隆到表达载体pET-30a中，得到重组表达质粒，转化宿主菌BL21(DE3),并用IPTG诱导蛋白表达，经纯化得到RAP-1蛋白，作为诊断抗原的纯化RAP-1蛋白。将抗原以适当的浓度包被96孔酶标板，用间接ELISA法检测已知新疆巴贝斯虫未定种感染的绵羊和山羊血清、健康绵羊和山羊血清及野外绵羊和山羊血清，确定大肠杆菌表达的RAP-1蛋白作为检测抗原的敏感性和特异性，从而完成了本专利技术。本专利技术提供了(1)一种用于检测羊新疆巴贝斯虫病的ELISA诊断试剂盒，其特征在于，包含大肠杆菌表达系统所制备的重组RAP-1蛋白作为检测血清中抗羊新疆巴贝斯虫特异性抗体的抗原，所述重组RAP-1蛋白是由SEQIDNO.3构成的重组表达质粒pET30a在大肠杆菌表达系统中的表达产物，所述大肠杆菌菌株是BL21(DE3)plysS。(2)如(1)所述的诊断试剂盒，其特征在于，在制备所述重组RAP-1蛋白时，在大肠杆菌菌液中加入终浓度为1mM的柠檬酸替代IPTG。(3)一种用于检测羊新疆巴贝斯虫病的间接ELISA方法，包含如下步骤：①包被：以包被缓冲液将大肠杆菌表达系统所制备的重组RAP-1蛋白稀释至工作浓度，加入96孔酶标板，每孔100μL，37℃放置1小时后，4℃过夜，以洗涤缓冲液PBST洗涤，拍干，所述重组RAP-1蛋白是由SEQIDNO.3构成的重组表达质粒pET30a在大肠杆菌表达系统中的表达产物；②封闭：每孔加入200μL封闭液，37℃封闭1小时，以洗涤缓冲液PBST洗涤，拍干；③与一抗结合：待检血清样品及任选的阳性和阴性对照用PBST以1：100稀释，每孔加入100μL，37℃结合1小时，以洗涤缓冲液PBST洗涤，拍干；④与二抗结合：鼠抗绵羊或山羊IgG/HRP用PBST1：10000稀释，每孔加入100μL，37℃结合1小时，以洗涤缓冲液PBST洗涤，拍干；⑤显色：每孔加入100μLUltraTMB，37℃避光10-20分钟；⑥终止：每孔加入100μL2MH2SO4，测定OD450。⑦结果判定：效价小于29.1时判定为阴性性；效价大于29.1判定为阳性。本专利技术的效果根据本专利技术的方法，可以快速，高效且特异性地检测新疆巴贝斯虫感染的绵羊和山羊。本专利技术利用PCR扩增获得的棒状体相关蛋白(RAP-1)基因序列，克隆表达获得RAP-1重组蛋白。经动物免疫、Westernblotting和ELISA试验表明，RAP-1重组蛋白均具有良好的免疫原性，反应原性和特异性。用RAP-1重组蛋白建立的间接ELISA方法，完全适用于我国羊巴贝斯虫病的血清学抗体检测和流行病学调查。本专利技术是国内外首次利用羊新疆巴贝斯虫未定种RAP-1重组蛋白建立的间接ELISA方法。经验证，该基因存在于羊新疆巴贝斯虫未定种的子孢子和裂殖子三阶段，所以本专利技术适用于由羊新疆巴贝斯虫未定种引起的羊巴贝斯虫病的感染阶段(包括本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测羊新疆巴贝斯虫病的ELISA诊断试剂盒，其特征在于，包含大肠杆菌表达系统所制备的重组RAP‑1蛋白作为检测血清中抗羊新疆巴贝斯虫特异性抗体的抗原，所述重组RAP‑1蛋白是由SEQ ID NO.3构成的重组表达质粒pET30a在大肠杆菌表达系统中的表达产物，所述大肠杆菌菌株是BL21(DE3)plysS。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测羊新疆巴贝斯虫病的ELISA诊断试剂盒，其特征在于，包含大肠杆菌表达系统所制备的重组RAP-1蛋白作为检测血清中抗羊新疆巴贝斯虫特异性抗体的抗原，所述重组RAP-1蛋白是由SEQIDNO.3构成的重组表达质粒pET30a在大肠杆菌表达系统中的表达产物，所述大肠杆菌菌株是BL21(DE3)plysS。2.如权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征在于，在制备所述重组RAP-1蛋白时，在大肠杆菌菌液中加入终浓度为1mM的柠檬酸替代IPTG。3.一种用于检测羊新疆巴贝斯虫病的间接ELISA方法，包含如下步骤：①包被：以包被缓冲液将大肠杆菌表达系统所制备的重组RAP-1蛋白稀释至工作浓度，加入96孔酶标板，每孔100μL，37℃放置1小时后，4℃过夜，以洗涤缓冲液PBST洗涤...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛庆丽，刘志杰，杨吉飞，关贵全，李有全，殷宏，罗建勋，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62