免疫兔血清中猪圆环病毒PCV2抗体水平间接Elisa检测试剂盒及其检测方法和应用技术

本发明专利技术提供免疫兔血清中猪圆环病毒PCV2抗体水平间接Elisa检测试剂盒，所述试剂盒以PCV2病毒基因组开放阅读框ORF2编码的重组蛋白为包被抗原。本发明专利技术还提供其检测方法和应用。本发明专利技术的检测免疫兔血清PCV2抗体水平的间接ELISA方法可以用于充分评价免疫兔血清中针对PCV2的抗体水平。

【技术实现步骤摘要】
免疫兔血清中猪圆环病毒PCV2抗体水平间接Elisa检测试剂盒及其检测方法和应用
本专利技术涉及免疫兔血清中猪圆环病毒PCV2抗体水平间接Elisa检测试剂盒及其检测方法和应用。
技术介绍
猪圆环病毒(Porcinecircovirus，PCV)是迄今为止发现的一种最小的动物病毒。现已知PCV有两个血清型，即PCV1和PCV2。PCV1为非致病性的病毒。PCV2为致病性的病毒，它是断奶仔猪多系统衰竭综合征的主要病原。PCV2是一种DNA病毒，目前关于PCV2的致病机制还不清楚。及时快速的诊断对有效控制疫病具有重要意义。抗体是分析PCV2致病机制和建立相应的诊断方法的最基本物质材料，免疫兔血清是最常见的一种类型抗体，通过重组抗原检测免疫兔血清抗体的有效性，对充分保障抗体乃至在此基础上建立的其它检测方法的可靠性具有重要意义。PCV2病毒粒子直径14－17nm，呈20面体对称结构，无囊膜，含有共价闭合的单股环状负链DNA。基因组全长为1768bp或1767bp，毒株间的核苷酸序列同源性大于96％。基因组有两个主要的开放阅读框(openreadingframe,ORF)，即ORF1和ORF2。ORF1编码病毒的复制酶，与病毒的复制转录有关。ORF2编码病毒的结构蛋白即衣壳蛋白Cap，可以与PCV2的抗血清反应。所以，Cap重组蛋白常常用于抗体的诊断和检测。目前检测PCV2抗体水平的方法主要是酶联免疫吸附分析方法(enzyme-linkedimmunoadsorbentassay,ELISA)，该方法由于简便、快速、灵敏、特异等优点逐渐取代传统的琼脂扩散法。兔子是制备免疫血清的主要动物之一，通过反复免疫可以产生高效价的抗体，这些抗血清经过纯化以及进一步的标记后，可以用于ELISA、免疫组化、流式细胞术以及激光共聚焦等免疫学分析。所以，首先建立起能够充分评价免疫兔血清的ELISA方法具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术提供了免疫兔血清中猪圆环病毒PCV2抗体水平间接Elisa检测试剂盒，能够很好的检测免疫兔血清中的抗体水平，为此，本专利技术还提供其检测方法和应用。本专利技术提供免疫兔血清中猪圆环病毒PCV2抗体水平间接Elisa检测试剂盒，所述试剂盒以PCV2病毒基因组开发阅读框ORF2编码的重组蛋白为包被抗原。优选地，所述重组蛋白的氨基酸序列参见SEQIDNo.2。进一步地，所述重组蛋白的制备方法为：将PCV2的Cap编码基因克隆至pET30a(+)表达载体的多克隆位点处，获得重组表达质粒，将重组质粒转入宿主感受态细胞中，经筛选鉴定获得重组表达菌株，在IPTG诱导下，表达PCV2-rCap，经过镍柱亲和层析，获得了纯化的PCV2-rCap。优选地，所述试剂盒包括一抗抗体稀释液，所述一抗抗体稀释液为：含有2％pET30a-E.Coli菌体裂解液,5％脱脂奶粉和5％BSA的PBST。所述百分比为质量体积比。优选地，所述试剂盒还包括酶标二抗，所述酶标二抗为山羊抗兔二抗，所述酶为辣根过氧化物酶。进一步地，所述酶标二抗的稀释度为1:2000。优选地，所述试剂盒中包被抗原的包被浓度为：100ng/100μL。本专利技术的第二个目的是提供免疫兔血清中猪圆环病毒PCV2抗体水平的间接Elisa检测方法，步骤如下：(1)包被酶标板：将纯化后的PCV2-rCap-pET30a重组蛋白和pET30a-E.Coli菌体蛋白分别包被微孔板，洗涤；(2)封闭酶标板，洗涤；所述封闭剂优选含有5％脱脂奶粉的PBST；(3)加入稀释后的兔血清一抗，洗涤；稀释兔血清一抗所用的稀释液优选为含有2％pET30a-E.Coli菌体裂解液,5％脱脂奶粉和5％BSA的PBST；所述百分比为质量体积比；(4)加入稀释后的酶标二抗，37℃恒温箱温育1小时，洗涤；稀释酶标二抗所用的稀释液优选含有5％脱脂奶粉的PBST稀释液；选择此浓度的稀释液效果最佳。(5)显色，终止并在酶标仪上读取OD490nm的光吸收值。优选地，所述重组蛋白的纯化方法为：采用镍柱亲和层析法纯化所述重组蛋白，具体为：先用包涵体洗涤液洗涤重组蛋白包涵体，离心保留沉淀后再用尿素洗涤，然后用bufferB溶解包涵体沉淀，离心收集上清液，将上清液加入平衡后的镍柱，室温结合；之后先后用BufferC和BufferD洗柱子，收集组分，最后用BufferE洗柱子收集组分。本专利技术的第三个目的是提供上述试剂盒在检测免疫兔血清猪圆环病毒PCV2抗体水平中的应用。本专利技术的方法除了采用针对兔血清的抗体稀释液处理兔血清降低非特异性反应外，同时还以适量(与PCV2-rCap包被酶标板的量相一致)的pET30a-E.Coli的菌体裂解液为包被抗原包被酶标板，平行检测免疫兔血清抗体水平，最大限度地排除免疫血清的非特异性反应，更能够充分评价免疫兔血清的PCV2抗体效价。本专利技术的检测免疫兔血清PCV2抗体水平的间接ELISA方法可以用于充分评价兔血清中针对PCV2的抗体水平。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1为pCV2-rCap(121-669bp)-pET30a[+]重组质粒双酶切鉴定图谱。M为核酸分子质量标准，1为采用BamHI和XhoI双酶切阳性重组质粒。图2为PCV2-rCap的诱导表达与纯化图谱.M为蛋白质分子质量标准，1为含有空载体的宿主菌即pET30a-BL21(DE)3的IPTG诱导表达的菌体蛋白；2为含有PCV2-Cap基因的重组表达载体菌株即pET30a-PCV2-Cap-BL21(DE)3的未诱导表达菌体蛋白；3为含有PCV2-Cap基因的重组表达载体菌株即pET30a-PCV2-Cap-BL21(DE)3的IPTG诱导表达菌体蛋白；4为采用镍柱亲和层析法纯化后的PCV2-rCap。图3为采用三种不同的兔血清抗体稀释液稀释标准兔血清，分别进行PCV2-rCap和pET30a-E.Coli包被的ELISA检测。纵坐标代表OD492nm的光吸收值，横坐标代表不同的兔血清抗体稀释液类别，其中“1”代表第一种抗体稀释液即含有10％马血清，2％pET30a-E.Coli菌体裂解液，5％脱脂奶粉和5％BSA的PBST；“2”代表第二种抗体稀释液即为含2％pET30a-E.Coli菌体裂解液，5％脱脂奶粉和5％BSA的PBST；“3”代表第三种抗体稀释液即是含5％脱脂奶粉和5％BSA的PBST。内部带有斜纹的柱形图代表包被PCV2-rCap进行ELISA检测标准兔血清(1:1000稀释)，内部带有网格的柱形图代表包被pET30a-E.Coli进行ELISA检测标准兔血清(1:1000稀释)。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。实施例1重组PCV2的衣壳蛋白即PCV2-rCap的制备1.PCV2-rCap的重组表达质粒构建以实验室保存的含有完整PCV2编码基因(共1767bp)的质粒为模板，以P163-F(5-cgcggatccatgaaaaatggcatcttcaaca本文档来自技高网...

【技术保护点】
免疫兔血清中猪圆环病毒PCV2抗体水平间接Elisa检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒以PCV2病毒基因组开放阅读框ORF2编码的重组蛋白为包被抗原。

【技术特征摘要】
1.免疫兔血清中猪圆环病毒PCV2抗体水平间接Elisa检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒以PCV2病毒基因组开放阅读框ORF2编码的重组蛋白为包被抗原，以pET30a-E.Coli的菌体裂解液为对照包被物，所述重组蛋白的氨基酸序列为SEQIDNo.2，所述试剂盒中包被抗原的包被浓度为：100ng/100μL；所述试剂盒还包括一抗抗体稀释液，所述一抗抗体稀释液为：含有2%pET30a-E.Coli菌体裂解液,5%脱脂奶粉和5%BSA的PBS...

【专利技术属性】
技术研发人员：张杰，陈豪泰，丁耀忠，张永光，王永录，常惠芸，潘丽，邵军军，吕建亮，周鹏，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62