本发明专利技术涉及一种用于检测猪输血传播病毒2型（TTV2）抗体的间接ELISA试剂盒，属于生物技术领域。包括抗原重组蛋白的制备、间接ELISA的建立、判定标准及临床血清学检测的应用。所述的抗原重组蛋白是利用pcoldI原核表达载体，构建表达猪TTV2ORF1截短蛋白的基因工程菌pcoldI-ORF1，并将表达的重组蛋白纯化作为抗原建立了间接ELISA检测方法。该方法用于检测猪血清中TTV2的抗体水平具有重复性好、特异性高的特点，可用于猪TTV2的血清学调查，为该病的防治和流行情况的掌握提供一种快速、简便的血清学检测方法。目前该方法是国内首次利用猪TTV2ORF1重组蛋白建立检测猪群中TTV2抗体的ELISA检测方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于检测猪输血传播病毒2型(即猪TTV2)抗体的间接ELISA试剂盒，属于兽医生物
技术介绍
TTV (Torque Teno virus)又名输血传播病毒，属指环病毒科(Anelloviridae),壬型细环病毒属(1tatorquevirus),是一种无囊膜的单股环状负链DNA病毒。最早是由日本学者Nishizawa等于1997年发现的，由于该病毒是从肝炎患者体内分离获得的，因此怀疑其与肝炎有关，从而引起了高度关注。随后各国对本国不同人群中TTV感染情况进行了流行病学调查，结果发现人群中TTV DNA阳性率一般在10%以上。目前已经证实，除了人类可以感染TTV以外，在灵长类动物(黑猩猩、类人猿和猴)、家畜(猪、牛、羊、犬、猫、鸡)和其它动物(老鼠、树駒和骆驼)体内均相继检测到了 TTV的存在。研究表明TTV已经在世界猪群中广泛存在，并且可能与某些疾病的引起有关，因此已在全球引起重视。Segales J等对1985年-2005年间，采自西班牙99个猪场的162份血清样品进行TTV检测，结果在 所有年份中均检测出猪TTV，在母猪和肉猪中，TTVl的阳性率分别为34.2%和30.9%, TTV2的阳性率分别为46.6%和62.8%, TTVl和TTV2共感染率分别为19.8%和24.5%,该结果表明至少在1985年猪TTV就已经存在于西班牙猪场中。Martinez等对西班牙178头野猪中TTV的感染情况进行了调查，结果总阳性率为84%，TTVl和TTV2的阳性率分别为58%和66%，TTVl和TTV2共同感染的阳性率为18%，但该结果被认为与地理位置有关。王礞礞等首次对国内来自广东、福建和江西等7个省份的258份猪血液样品和组织样品进行了检测，结果表明猪群中TTVl和TTV2感染阳性率分别为37.6%和82.6%，TTV2阳性率明显高于TTVl，二者的混合感染率为34.5%，证实我国猪群中存在TTV感染，并且以TTV2较为流行。该病毒经常与其他病毒发生共同感染。McKeown N E等研究表明，该病毒与已知病原的混合感染能够增加疾病的严重性，而且该病毒具有潜在的跨种传播给人的危害，这也提示我们不能忽视对该病毒的研究。对于新发疫病的诊断和防制工作是科研工作者首要解决的关键，目前只有通过PCR技术扩增TTV的核酸来诊断，建立该病毒的抗体检测方法，对该病的流行病学调查、免疫效果的评价等极有意义，而ELISA因具有检测通量大、结果确切、灵敏度高、易于基层推广等特点而倍受欢迎，成为目前应用最广泛的一种血清学检测方法。由于目前猪TTV尚不能在体外培养中得到很好的增殖，所以通过分子生物学方法大量表达TTV的抗原蛋白并以此作为包被抗原建立检测猪血清中抗TTV抗体的ELISA成为最佳选择。猪TTV分为两个亚型，即TTVl和TTV2，基因组之间变异的一个突出特点是，与TTV2相比，TTVl有大量的变异位点，即TTVl的变异性比TTV2的大。在TTVl中，总共有1349个变异位点，平均每个变异位点有1.27个替代物，在TTV2中变异位点比较少，共有670个。此外，ORFs之间的突变模式也是不同的:0RF1可能编码病毒衣壳蛋白(Cap)和复制相关蛋白(Rep)，比较保守，在密码子的第三个位置的变化率比较高，尽管已经报道了 0RF2和0RF3的一些保守区域，但相对来说，二者的保守性比较低。且我国TTV的流行情况表明，TTV2感染率明显高于TTVl，我国TTV2较为流行。因此，本专利技术以猪TTV流行亚型TTV2的相对保守基因ORFl基因为模板，进行原核表达、纯化，利用纯化的重组蛋白作为抗原建立间接ELISA检测方法，为该病毒的早期诊断以及大规模的检测提供了技术手段。
技术实现思路
技术问题 本专利技术的目的是提供一种能快速、简便地检测猪TTV2血清抗体的间接ELISA试剂盒，即利用pcoldl原核表达载体，构建了能表达猪TTV2 ORFl部分基因的载体，并将表达的重组蛋白纯化后包被ELISA板，以检测猪血清中TTV2的抗体水平。技术方案 本专利技术通过以下步骤实现: 一种能快速、简便地检测 猪TTV2血清抗体的间接ELISA试剂盒，试剂盒内设有抗体检测板，封闭液，样品稀释液，洗涤液，酶结合物工作液，酶底物溶液，终止液，阳性对照和阴性对照；其中抗体检测板为包被猪TTV2重组ORFl蛋白的可拆96孔酶标板，酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记山羊抗猪IgG多克隆抗体，阳性对照为猪TTV2标准阳性血清，阴性对照为猪标准阴性血清，包被猪TTV2重组ORFl蛋白序列如下: IDLTEPWLEGWGNAFYSVLGYEAIKDQGHWSNWAQIKYYWIYDTGVGNAVY 5I VVMLKKDIDDNPGRMATEFKTTPGQHPNAIDHIELINEGWPYWLYFFGKS 101 EQDIKKEAHSEEIAREYATNPKSKKLKIGIVGWASSNFTTPGSSQNVGGN 151 TAAIQGGYVAWAGGQGKLNLGAGSIGNLYQQGWPSNQNWPNTNRDETNFD 20I WGLRSLCMLRDNMQLGSQELDDECTMLSLFGPFVEKANPIFATTDPKYFK 251 PELKDYNUMKYAFKFQWGGHGTERFKTTI ⑶ PSTIPCPFEP ⑶ RFHSGI 30I QDPSKVQNTVLNPWDYDCDGIVRKDTLKRLLELPTETEEEKAYPLLGQKT 351 EKEPLSDSDEESVISSTSSGSSQEEETQRRKHHKPSKRRLLKHLQRVVKR 401 MKT。所述的猪TTV2重组ORFl蛋白是由原核表达质粒pcoldl-ORFl表达的，原核表达质粒pcoldl-ORFl是由以下方法构建而成的: O利用基因工程重组技术构建猪TTV2 ORFl部分基因的原核表达质粒，命名为pcoldl-ORFl ;是由以下方法构建而成的，设计了一对含有酶切位点的引物:SFORF1: CCGCTTG^GACTTAACGGAACCGTGGCTAGAAG {Xho I)SR0RF1: CCCA4 化T7TGTTTTCATCCTCTTTACCACCCGCTGGA {Hindi II) 利用上述特异性引物，从TTV2阳性病料中扩增基因片段，得到1227bp的扩增片段，再利用各自引物上的限制性内切酶，分别对PCR扩增产物和pcoldl载体进行酶切，用T4 DNA连接酶顺次将酶切的PCR扩增片段连接到pcoldl上。具体来说，首先将pcoldl载体和SF0RF1与SR0RF1引物扩增的片段分别经通ol和历/^III酶切，回收各自的酶切片段，用T4 DNA连接酶连接，构建pcoldl-ORFl载体，连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态中，提取质粒，挑选酶切鉴定正确的克隆进行测序鉴定。挑取经通ol和历/^III双酶切出1215bp条带的质粒进行测序，测序结果表明目的片段与pcoldl载体正确相连，表达蛋白的阅读框正确，结果表明重组原核表达载体质粒pcoldl-ORFl构建成功。2)将质粒pcoldl-ORFl转化宿主菌大肠本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种猪输血传播病毒2型(TTV2)抗体间接ELISA诊断试剂盒，其特征在于：试剂盒内设有抗体检测板，封闭液，样品稀释液，洗涤液，酶结合物工作液，酶底物溶液，终止液，阳性对照和阴性对照；其中抗体检测板为包被猪TTV2重组ORF1蛋白的可拆96孔酶标板，酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记山羊抗猪IgG多克隆抗体，阳性对照为猪TTV2标准阳性血清，阴性对照为猪标准阴性血清，包被猪TTV2重组ORF1蛋白序列如下：1????DLTEPWLEGWGNAFYSVLGYEAIKDQGHWSNWAQIKYYWIYDTGVGNAVY51???VVMLKKDIDDNPGRMATEFKTTPGQHPNAIDHIELINEGWPYWLYFFGKS101??EQDIKKEAHSEEIAREYATNPKSKKLKIGIVGWASSNFTTPGSSQNVGGN151??TAAIQGGYVAWAGGQGKLNLGAGSIGNLYQQGWPSNQNWPNTNRDETNFD201??WGLRSLCMLRDNMQLGSQELDDECTMLSLFGPFVEKANPIFATTDPKYFK251??PELKDYNLIMKYAFKFQWGGHGTERFKTTIGDPSTIPCPFEPGDRFHSGI301??QDPSKVQNTVLNPWDYDCDGIVRKDTLKRLLELPTETEEEKAYPLLGQKT351??EKEPLSDSDEESVISSTSSGSSQEEETQRRKHHKPSKRRLLKHLQRVVKR401??MKT。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：何孔旺，王小敏，张文文，倪艳秀，温立斌，俞正玉，张雪寒，郭容利，吕立新，李彬，周俊明，茅爱华，叶青，汪伟，周萍，沈江萍，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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