【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及兽医生物制品领域,更具体的说是涉及基于特异蛋白的一种牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
牛多杀性巴氏杆菌(Bovine Pasteurella multocida,Pm)是一种引起牛发生出血性败血症或呼吸系统疾病的重要病原菌。多杀性巴氏杆菌根据其菌体荚膜抗原的不同,可分为A、B、D、E和F 5种荚膜血清型,其中对牛致病的荚膜血清型有A、B、E及F型;A和F型主要导致牛呼吸系统疾病,B和E型主要导致牛出血性败血症。以往我国流行的牛多杀性巴氏杆菌病主要由荚膜血清B型引起,自2008年以来,A型多杀性巴氏杆菌病在我国许多省市相继流行,给养牛业造成了重大经济损失。目前,国内外针对疾病诊断和疫苗效力的检测方法主要有病原分离鉴定、PCR检测技术、琼脂扩散试验、间接血凝试验以及ELISA试验等。PCR检测技术主要用于实验室研究,琼脂扩散试验和间接血凝试验敏感性较低, ELISA检测方法具有灵敏性高和易批量检测等优点。对于疫病诊断与疫苗效力检测,其ELISA抗体检测试剂盒具有一定差异,用于疫病诊断的ELISA抗体检测试剂盒要求靶标抗原特异(最好能区分感染抗体与免疫抗体,如不能区分则只能用于未免疫动物疫病诊断);而用于疫苗效力检验的ELISA抗体检测试剂盒则要求所用靶标抗原为特异性保护性抗原,所检测抗体水平要与其免疫保护性呈现正相关性,传统疫苗中不是所有的抗原成分免疫产生的抗体水平都会与该疫苗的保护性呈现正相关,因此用于疫苗效力检测的ELISA抗体检测试剂盒的抗原选择就尤为重要。目前我国尚无用于牛多杀性巴氏杆菌病血清流行 ...
【技术保护点】
一种牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒,其特征在于,包括用牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230包被的固相载体、HRP标记的IgG酶标二抗、标准阳性对照血清、标准阴性对照血清、样品稀释液、浓缩洗涤液、显色液和终止液;其中,所述牛源多杀性巴氏杆菌特异蛋白0230的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示;所述标准阳性对照血清为犊牛感染牛源多杀性巴氏杆菌后的血清,标准阴性对照血清为未免疫和未感染多杀性巴氏杆菌的犊牛血清。
【技术特征摘要】
1.一种牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒,其特征在于,包括用牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230包被的固相载体、HRP标记的IgG酶标二抗、标准阳性对照血清、标准阴性对照血清、样品稀释液、浓缩洗涤液、显色液和终止液;其中,所述牛源多杀性巴氏杆菌特异蛋白0230的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示;所述标准阳性对照血清为犊牛感染牛源多杀性巴氏杆菌后的血清,标准阴性对照血清为未免疫和未感染多杀性巴氏杆菌的犊牛血清。2.根据权利要求1牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒,其特征在于,所述牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230采用如下方法获得:以牛源多杀性巴氏杆菌荚膜血清A型CQ2菌株的DNA作为模板,利用设计合成的特异性引物进行PCR扩增,回收PCR扩增后的目的基因片段,将所述目的基因片段与原核表达载体pET30a连接,构建重组表达质粒pET30a-Pm0230,将重组表达质粒pET30a-Pm0230转化入大肠杆菌 E.coli BL21(DE3)感受态细胞,并采用异丙基硫代半乳糖苷诱导表达,将获得的表达产物经过His标签纯化柱纯化和透析除盐处理,获得所述牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230;所述特异性引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。3.根据权利要求1所述牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒,其特征在于,所述样品稀释液为含0.5 wt.% BSA、0.05 wt.% 吐温20、5 mmol/L EDTA和0.35 mol/L NaCl的PBS缓冲液,所述样品稀释液的pH为7.2。4.根据权利要求1所述牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒,其特征在于,所述浓缩洗涤液为25×PBST 洗涤液。5.根据权利要求1所述牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒,其特征在于,所述显色液为TMB,反应终止液为2 mol/L的硫酸溶液。6.根据权利要求1所述牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒,其特征在于,所述用牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230包被的固相载体采用如下方法制得:向固相载体中加入浓度为10 μg/mL的牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230溶液,于4 ℃包被过夜后,弃去所述牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230溶液,向固相载体中加入质量浓度为1 %的卵清蛋白溶液,于37 ℃下封闭1.5 h。7.根据权利要求1所述牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒,其特征在于,所述固相载体为96孔聚苯乙烯酶标板。8.根据权利要求1所述牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒,其特征在于,所述HRP标记的IgG...
【专利技术属性】
技术研发人员:彭远义,李能章,程蓉,李杜,赵益萍,刘舒萍,
申请(专利权)人:西南大学,
类型:发明
国别省市:重庆;50
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