一种3’端可逆封闭的两核苷酸实时合成测序方法技术

本发明专利技术公开了一种3’端可逆封闭的两核苷酸实时合成测序方法，单个测序反应由X、Y两个不同的3端修饰核苷酸同时进行；整个测序包括对同一模板进行的至少二组测序反应：每组测序由包含四个3端修饰核苷酸，按照每个核苷酸在一个循环中只使用一次的方式，进行由两个不同核苷酸同时合成测序反应的循环，若干次测序反应后得到由一组按照测序顺序排列的若干XY信息；当该组测序反应完成后，变性将测序引物延伸链清除，重新杂交测序引物，进行第二组测序反应，得到第二测序反应排列的若干XY信息，最后通过解码二组按照测序顺序排列的若干XY信息，组装出待测核酸片段的具体碱基序列。本发明专利技术可以消除现有实时合成测序对同聚物片段的测序错误。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，是一种实现核酸序列高通量测定的方法，具体涉及一种两核苷酸实时合成DNA测序方法及其应用。
技术介绍
随着人类基因组计划和各种模式生物基因组计划的开展和完成，使人类步入了后基因时代，对当代的生物学研究和医学研究产生了巨大的影响，分子生物学相关学科得到了迅猛的发展。从基因水平上认识生命的差异，疾病发生、发展的规律，以及药物与生命体的相互作用将成为可能。大幅度降低DNA测序的成本将会大大推动生命科学和医学的研究，甚至会带来革命性的变化。目前，全基因组DNA测序技术已经成为国际上一个竞争十分激烈的研究领域。如Roche公司基于乳液PCR产物的高通量并行焦测序技术；Illumina公司的桥式扩增-DNA芯片延伸测序技术；以及AppliedBiosestems公司基于乳液PCR产物的杂交-酶连接-酶切割的SOLiD平台、pH敏感场效应管阵列芯片的IonTorrent平台等高通量测序技术都有成熟的商品化仪器上市。聚合酶链式反应(PCR)表明合成延伸反应理论上合成测序方法可以测定数千甚至上万个碱基，这无疑代表高通量核酸测序的巨大潜力。然而现有的合成测序要么是简单地每次只加一种核苷酸的方法通过确定每次合成的碱基的个数，或者通过3端羟基可逆封闭的特殊核苷酸单体一次只延伸一个核苷酸的方法确定每次合成的碱基种类的来实现的。前者需要四个独立的反应来完成所有模板的一个碱基的测定而增加测序时间，而后者由于在测定下一个碱基前需要将3端羟基的保护基团脱出，而每增加一步反应将导致反应效率的降低，最终导致测序长度的下降。利用检测天然核苷酸单体合成反应实时产生的焦磷酸盐、氢离子而发展的454高通量测序技术(Margulies,etal.Nature,2005.437(7057):376-380)、IonTorrent测序技术(Rothberg,etal.Nature,475348–352)允许原始DNA的合成，核苷酸被合成后无需进行任何处理步骤，测序过程相当快、且序列阅读长度要比荧光标记核苷酸单体的合成测序方法高数倍。我们将两核苷酸合成测序技术应用到上述实时合成测序中，并提出“一种两核苷酸实时合成解码测序方法”(中国专利技术专利：ZL201210128597.9)可以进一步提高序列测定的长度。然而，这一专利技术仍然存在一些不足，对于同聚物(如AAAAAAAAAA等片段)、或者类准同聚物(如AC/GT循环测序中的AACCAAACAACAA等片段)测序获得的信号强度与碱基个数并不成完全的线性关系，造成测序信息的错误。在现有的荧光标记核苷酸合成测序中，可以通过3’端羟基可逆封闭的特殊核苷酸单体一次只延伸一个核苷酸的方法确定每次合成的碱基种类的来实现序列测定，这样就可以避免同聚物或者类准同聚物的测序错误。诸如同样的道理，如果采用通过3端羟基可逆封闭的特殊核苷酸单体来实施实时合成测序，那么这种测序方法就能够既保持实时合成测序优点的同时，又克服同聚物或者类准同聚物的测序错误。有关3’端羟基可逆封闭的特殊核苷酸单体包括3’-O-烯丙基修饰的核苷酸(PNAS,2006,103,19635-19640)，3’-O-氰乙基修饰的核苷酸(Chem.Eur.J.2011,17,2903-2915)，3’-O-叠氮甲基修饰的核苷酸((PNAS,2006,105,9145–9150)和3’-O-氨基修饰的核苷酸((PNAS,2010,107,1948–1953)，以及3’端虚拟封闭的核苷酸(NatMethods.2009,6,593–595)等。
技术实现思路
本专利技术的目的是利用3’端羟基可逆封闭的特殊核苷酸单体为测序原料，提供一种3’端可逆封闭的两核苷酸实时合成测序方法，实现待测核酸序列的高通量检测。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种3’端可逆封闭的两核苷酸实时合成测序方法，其特征在于：单个测序反应由X、Y两个不同的3’端可逆封闭的核苷酸同时进行，每次测序反应最多只能产生一个核苷酸的合成，得到一个碱基序编码信息XY；或者没有发生核苷酸合成反应的信息；整个测序包括对同一模板进行的至少二组测序反应：每组测序由包含四个3’端可逆封闭的核苷酸，其中，所述的四个3’端可逆封闭的核苷酸用A*、C*、G*、T*表示，按照每个核苷酸在一个循环中只使用一次的方式，进行由两个不同核苷酸同时合成测序反应的循环，若干次测序反应后得到由一组按照测序顺序排列的若干XY信息；当该组测序反应完成后，变性将测序引物延伸链清除，重新杂交测序引物，进行第二组测序反应，得到第二测序反应排列的若干XY信息；最后通过解码二组按照测序顺序排列的若干XY信息，组装出待测核酸片段的具体碱基序列。所述核苷酸的3’端可逆封闭基团是指在指定反应条件下能够被脱出、并活化出核苷酸的3’端羟基。所述核苷酸的3‘端羟基是被包括3’-O-烯丙基、3’-O-氰乙基、3’-O-叠氮甲基、3’-O-氨基中的一个或多个基团封闭，形成3‘端修饰的核苷酸；这些3‘端修饰的核苷酸能够参与合成测序反应，且最多只能发生一个核苷酸的合成。所述的单个测序反应由X、Y两个不同的3’端可逆封闭的核苷酸是指由(A*+C*)、(A*+G*)、(A*+T*)、(C*+G*)、(C*+T*)、(G*+T*)六种组合中任一种两核苷酸同时进行的合成测序反应。所述的整个测序包括对同一模板进行的至少二组测序反应是指(A*+C*)/(G*+T*)，(A*+G*)/(C*+T*)，(A*+T*)/(C*+G*)三组中任意两组两核苷酸合成循环对同一模板的测序。所述核苷酸合成实时产生的检测分子相同的，其检测分子是化学发光检测的焦磷酸盐，电化学检测的氢离子或者光学检测的荧光分子。所述的待测核酸片段是指单分子，或者以单分子为模板扩增的相同序列产物。所述待测核酸片段的具体碱基信息是通过解码二组碱基片段编码信息而得到的；对于有参考序列的基因组测序的再测序，两组核苷酸实时合成DNA测序得到的编码直接用于基因组参考序列的比对。不同待测核酸序列的并行测序中，每个模板需要独立的微反应池。本专利技术的具体步骤为：a：大肠杆菌基因组全基因组模板制备：将目标基因组用超声破碎成大小为100-1000bp碱基的片段，并在连接酶的作用下将这些片段化核酸序列用一对序列已知道的通用连接子进行连接，其中连接子1的序列为：CTGCTGTACCGTACAGCCTTGGCCG，连接子2的序列为：CGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT；并进行预扩增10个循环；然后凝胶电泳切割200-800bpDNA片段，并纯化；将这些200-800bpDNA片段与固定其中一个连接子互补序列的微珠进行乳液并行PCR反应，扩增片段化的大肠杆菌基因组片段，并变性得到大肠杆菌基因组测序DNA模板，最后，将这些扩增双链DNA模板的微珠放置到具有反应池的芯片上，每个反应池最多容纳一个微珠；b.测序引物杂交：将5’端固定的模板与能和3’端连接子互补的引物杂交，杂交引物作为所有大肠杆菌基因组DNA模板的测序引物；c.测序第一组测序反应：将5’端固定的模板与能和3’端连接子互补的引物杂交，杂交引物作为所有大肠杆菌基因组DNA模板的测序引物；(1.1)将100uM的3’-O-氨基修饰的核苷酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种3’端可逆封闭的两核苷酸实时合成测序方法，其特征在于：单个测序反应由X、Y两个不同的3’端可逆封闭的核苷酸同时进行，每次测序反应最多只能产生一个核苷酸的合成，得到一个碱基序编码信息XY；或者没有发生核苷酸合成反应的信息；整个测序包括对同一模板进行的至少二组测序反应：每组测序由包含四个3’端可逆封闭的核苷酸，其中，所述的四个3’端可逆封闭的核苷酸用A*、C*、G*、T*表示，按照每个核苷酸在一个循环中只使用一次的方式，进行由两个不同核苷酸同时合成测序反应的循环，若干次测序反应后得到由一组按照测序顺序排列的若干XY信息；当该组测序反应完成后，变性将测序引物延伸链清除，重新杂交测序引物，进行第二组测序反应，得到第二测序反应排列的若干XY信息；最后通过解码二组按照测序顺序排列的若干XY信息，组装出待测核酸片段的具体碱基序列。

【技术特征摘要】
1.一种3’端可逆封闭的两核苷酸实时合成测序方法，其特征在于：单个测序反应由X、Y两个不同的3’端可逆封闭的核苷酸同时进行，每次测序反应最多只能产生一个核苷酸的合成，得到一个碱基序编码信息XY；或者没有发生核苷酸合成反应的信息；整个测序包括对同一模板进行的至少二组测序反应：每组测序由包含四个3’端可逆封闭的核苷酸，其中，所述的四个3’端可逆封闭的核苷酸用A*、C*、G*、T*表示，按照每个核苷酸在一个循环中只使用一次的方式，进行由两个不同核苷酸同时合成测序反应的循环，若干次测序反应后得到由一组按照测序顺序排列的若干XY信息；当该组测序反应完成后，变性将测序引物延伸链清除，重新杂交测序引物，进行第二组测序反应，得到第二测序反应排列的若干XY信息；最后通过解码二组按照测序顺序排列的若干XY信息，组装出待测核酸片段的具体碱基序列。2.根据权利要求1所述的3’端可逆封闭的两核苷酸实时合成测序方法，其特征在于：所述核苷酸的3’端可逆封闭基团是指在指定反应条件下能够被脱出、并活化出核苷酸的3’端羟基。3.根据权利要求1或2所述的3’端可逆封闭的两核苷酸实时合成测序方法，其特征在于：所述核苷酸的3‘端羟基是被包括3’-O-烯丙基、3’-O-氰乙基、3’-O-叠氮甲基、3’-O-氨基中的一个或多个基团封闭，形成3‘端修饰的核苷酸；这些3‘端修饰的核苷酸能够参与合成测序反应，且最多只能发生一个核苷酸的合成。4.根据权利要求1所述的3’端可逆封闭的两核苷酸实时合成测序方法，其特征在于：所述的单个测序反应由X、Y两个不同的3’端可逆封闭的核苷酸是指由(A*+C*)、(A*+G*)、(A*+T*)、(C*+G*)、(C*+T*)、(G*+T*)六种组合中任一种两核苷酸同时进行的合成测序反应。5.根据权利要求1所述的3’端可逆封闭的两核苷酸实时合成测序方法，其特征在于：所述的整个测序包括对同一模板进行的至少二组测序反应是指(A*+C*)/(G*+T*)，(A*+G*)/(C*+T*)，(A*+T*)/(C*+G*)三组中任意两组两核苷酸合成循环对同一模板的测序。6.根据权利要求1所述的3’端可逆封闭的两核苷酸实时合成测序方法，其特征在于：所述核苷酸合成实时产生的检测分子相同的，其检测分子是化学发光检测的焦磷酸盐，电化学检测的氢离子或者光学检测的荧光分子。7.根据权利要求1所述的3’端可逆封闭的两核苷酸实时合成测序方法，其特征在于：所述的待测核酸片段是指单分子，或者以单分子为模板扩增的相同序列产物。8.根据权利要求1或7所述的3’端可逆封闭的两核苷酸实时合成测序方法，其特征在于：所述待测核酸片段的具体碱基信息是通过解码二组碱基片段编码信息而得到的；对于有参考序列的基因组测序的再测序，两组核苷酸实时合成DNA测序得到的编码直接用于基因组参考序列的比对。9.根据权利要求1所述的3’端可逆封闭的两核苷酸实时合成测序方法，其特征在于：不同待测核酸序列的并行测序中，每个模板需要独立的微反应池。10.根根据权利要求1所述的3’端可逆封闭的两核苷酸实时合成测序方法，其特征在于：具体步骤为：a：大肠杆菌基因组全基因组模板制备：将目标基因组用超声破碎成大...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖鹏峰，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32