本发明专利技术公开了17‑酮类固醇免疫原、抗体和检测试剂及制备方法。本发明专利技术制备的17‑酮类固醇免疫原，免疫原性高，可以诱导得到高效价的抗17‑酮类固醇特异性抗体，并且与常见的62种药物无任何交叉反应；由该抗体制备得到的17‑酮类固醇检测试剂，可以精确快速地确定尿液等生物样品中的17‑酮类固醇含量。与市场上现有的检测试剂比较，本发明专利技术检测试剂具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，还能有效降低17‑酮类固醇检测成本，有利于临床大规模推广使用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及17-酮类固醇免疫原、抗17-酮类固醇特异性抗体 和17-酮类固醇检测试剂。
技术介绍
17-酮类固醇（17-ketosteroids)，其结构式如式（III)所示： 17-酮类固醇是指皮质激素及性激素中在17碳位上有酮基者，包括雄酮、表雄酮、 去氢异雄酮、11-氧雄酮、11-羟雄酮等，大部分以结合形式存在。17-酮类固醇主要是肾上 腺及睾丸分泌的雄激素的代谢产物，女性和儿童尿液中的17-酮类固醇主要来源于肾上腺 皮质，男性尿液中的17-酮类固醇约2/3来源于肾上腺皮质、1/3来源于睾丸。尿17-酮类 固醇可反应肾上腺皮质激素、糖皮质激素及性腺分泌的总体情况，对于评价肾上腺分泌雄 激素的功能具有较大的价值。 经典的17-酮类固醇检测方法为比色测定法，此方法原理是基于此类在17位碳原 子上具有酮基的类固醇化合物在碱性溶液中与间位二硝基苯起反应，生成醌式化合物呈紫 红色，与进行同样处理的标准液比色分析即可求得含量。但此方法技术较为落后，稳定性较 差，已不适合临床上大批量使用。目前市场上缺乏稳定性好、灵敏度高、特异性强的17-酮 类固醇检测试剂，尤其是质量好的自动化检验试剂。因此，研发一种质量达到临床要求、实 用性强、性价比高，可应用于全自动生化分析仪的17-酮类固醇检测试剂势在必行。
技术实现思路
本专利技术为了克服现有技术存在的缺陷，采用独特的17-酮类固醇衍生物制备免疫 原性强的17-酮类固醇免疫原及其抗体，用该抗体制备的17-酮类固醇均相酶免疫检测试 剂可以实现在全自动生化分析仪上对17-酮类固醇高通量、快速化的检测。该检测试剂具 有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，还能有效降低17-酮类固醇检测成本， 有利于临床推广使用。 本专利技术的一个目的在于提供一种免疫原性强的17-酮类固醇免疫原。 本专利技术的另一个目的在于提供一种17-酮类固醇免疫原的制备方法。 本专利技术的又一个目的在于提供使用本专利技术17-酮类固醇免疫原制备得到的特异 性强的抗17-酮类固醇特异性抗体。 本专利技术的再一个目的在于提供一种17-酮类固醇检测试剂及其制备方法。 本专利技术的17-酮类固醇免疫原，免疫原性高，可以诱导得到高效价的抗17-酮类固 醇特异性抗体。该抗体特异性高，与17-酮类固醇的结合力强。由该抗体制备得到的17-酮 类固醇检测试剂，可以快速、准确地确定样品中的17-酮类固醇含量。本专利技术是通过以下技 术方案实现的： 一种17-酮类固醇免疫原，其结构式如式（I )所示： 载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽，优选为血清蛋白、血蓝蛋白和甲状腺球蛋 白，更优选为血清白蛋白，进一步优选为牛血清白蛋白。 所述的17-酮类固醇免疫原由17-酮类固醇衍生物与上述载体连接而成，17-酮类 固醇衍生物的化学结构如式（II )所示： 该17-酮类固醇免疫原的具体合成途径和方法如下： (1)将载体蛋白100~300mg溶解于25~75ml 0? 2M，pH 8. 5的磷酸缓冲液中； (2)将如下化学品加入到小烧杯中搅拌溶解：100~300mgl7-酮类固醇衍生物、 1. 75~5. 25ml二甲基甲酰胺、1. 75~5. 25ml乙醇、3. 5~10. 5ml 10mM，pH 5. 0的磷酸钾 缓冲液、100~300mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基）碳二亚胺、25~75mg N-羟基硫代琥 珀酰亚胺，将这些化学品在室温下搅拌溶解反应30~60min ; (3)将溶解好的溶液滴加至载体蛋白溶液中，并在2~8°C下搅拌过夜，得到抗原； 将合成好的抗原经过透析进行纯化，得到17-酮类固醇免疫原。 -种抗17-酮类固醇特异性抗体，由上述的17-酮类固醇免疫原免疫动物后生产 得到。 所述的抗17-酮类固醇特异性抗体由上述制得的17-酮类固醇免疫原采用常规方 法接种实验动物，加强免疫后取抗血清，具体步骤如下： (1)用PBS将上述合成的BSA-17-酮类固醇免疫原稀释至0? 1~3. Omg/ml，得到 抗原溶液，然后用0. 5~5. 0ml抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物进行注射； (2)2~3周后，再用0. 5~5. 0ml相同的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂对上述 实验动物注射一次，之后每隔四周注射一次，共计注射3~6次； (3)对上述实验动物取血，分离纯化得到效价为1:30000~1:50000的抗17-酮类 固醇特异性抗体。 本专利技术的抗17-酮类固醇特异性抗体为完整的抗体分子，也包括保留与17-酮类 固醇特异性结合能力的抗体片段或抗体衍生物。 本专利技术的抗体为采用单一的17-酮类固醇免疫原对动物加强免疫所获得的多克 隆抗体，或者为免疫后经体细胞杂交获得的单克隆抗体；所述的实验动物为兔、山羊、小鼠、 绵羊、豚鼠或马的一种，优选为兔。 本专利技术提供一种17-酮类固醇检测试剂，含有上述抗17-酮类固醇特异性抗体和 指示试剂。 本专利技术指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂、发光试剂。优选的，指 示试剂为酶试剂，由17-酮类固醇酶标偶联物和酶的底物所组成。 上述酶标偶联物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物；上述酶的底物为 葡萄糖-6-磷酸。 17-酮类固醇均相酶免疫检测试剂在使用之前，为了避免指示试剂中的酶标偶联 物和酶的底物发生反应，酶标偶联物和酶的底物是不混合的且分开放置，所以将酶的底物 与上述抗17-酮类固醇特异性抗体混合在一起。因此，17-酮类固醇均相酶免疫检测试剂包 括两类试剂： (1)试剂A由抗17-酮类固醇特异性抗体和均相酶底物混合而成，具体制备步骤如 下：1)将2. 018~8. 072g (5. 625~22. 50mM)氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD)、 0? 856 ~3. 422g(5. 625 ~22. 50mM)葡萄糖-6-磷酸（G-6-P)用 0? 5 ~2L 55mM、pH = 8. 0 的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物； 2)将制备的抗17-酮类固醇特异性抗体加到上述均相酶底物中，抗体与均相酶底 物的体积比为1:100~1:10000,优选为1:1000 ; (2)试剂B由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物与Tris缓冲液混合而成，制 备方法如下： 1)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6TOH)溶液的制备： a?称取7. 5~22. 5mg规格为100KU的G6PDH，室温溶解于6~18mL含有 72. 6mg(0. 05M)Tris、8mg MgCl2(3. 3mM)和 100mg NaCl 的溶液中，该溶液 pH = 9. 0 ;b?加入112. 5~337. 5mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH)，67. 5~ 202. 5mg葡萄糖_6_憐酸（G-6-P)以及0? 375~1. 125mL卡必醇； c?逐滴加入1~3mL二甲基亚砜； 2) 17-酮类固醇衍生物的激活： a.在无水状态下称取5~15mgl7_酮类固醇衍生物，溶解于300~900 y LDMF中； b.使上述溶液温度降到-2~-8 °C ; c?加入 1. 5 ~4. 5yL 三丁胺； d?加入0? 75~2. 25 y L氯甲酸异丁酯； e. _2 ~_8 °C本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种17‑酮类固醇免疫原，其结构式如式(Ⅰ)所示：载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽，选自血清蛋白、血蓝蛋白或甲状腺球蛋白中的一种，优选为血清蛋白，更优选为牛血清白蛋白。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：虞留明，岳育红，张顺利，梁玉芳，王清涛，
申请(专利权)人：苏州博源医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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