一种奥卡西平衍生物、免疫原、抗奥卡西平特异性抗体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种奥卡西平衍生物、免疫原、抗奥卡西平特异性抗体及其制备方法与应用。首先将新型奥卡西平衍生物与经过基因工程改造得到的重组人血清白蛋白偶联制得奥卡西平人工抗原，再用奥卡西平人工抗原免疫实验动物获得抗奥卡西平特异性抗体，经ELISA检测表明该特异性抗体的特异性强、灵敏度高，干扰实验显示该特异性抗体与100种常见药物无任何交叉反应；将抗奥卡西平特异性抗体应用于制备奥卡西平检测试剂，包括奥卡西平均相酶免疫检测试剂与奥卡西平胶乳增强免疫比浊检测试剂，所述检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对奥卡西平的高通量、快速化检测。快速化检测。快速化检测。

【技术实现步骤摘要】
一种奥卡西平衍生物、免疫原、抗奥卡西平特异性抗体及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及一种奥卡西平衍生物、免疫原、抗奥卡西平特异性抗体及其制备方法与应用，属于生物医学检测


技术介绍

[0002]奥卡西平（Oxcarbazepine）是被批准用于治疗成人和儿童部分性癫痫的辅助治疗或单药治疗的抗癫痫药物。奥卡西平的化学结构为10,11
‑
二氢
‑
10
‑
氧代
‑
5H
‑
二苯并[b，f]氮杂卓
‑5‑
甲酰胺，其代谢物10
‑
羟基卡马西平的化学结构为10,11
‑
二氢
‑
10
‑
氢卡马西平。奥卡西平可溶于DMSO、甲醇、水、乙醇和丙酮，在DMSO中溶解度≤9 mg/mL。10
‑
羟基卡马西平在甲醇中溶解度为100μg/mL。奥卡西平通过胃肠道快速吸收并迅速降解为有药理活性的代谢产物10
‑
羟基卡马西平（MHD）而发挥作用。多项研究表明，奥卡西平原型仅占血清中总放射活性的2%，因此临床上对奥卡西平治疗浓度的评价是通过对10
‑
羟基卡马西平浓度的检测来体现的。
[0003]奥卡西平的不良反应有：
①
过敏反应：服药患者出现躯干部、面颈部红色斑疹伴瘙痒，眼睑膜充血等症状；
②
低钠血症：患者用药后出现嗜睡，精神萎靡，四肢肌张力增高，血钠含量低于正常水平；
③
甲状腺功能异常；
④
尿潴留；
⑤
诱导癫痫发作；
⑥
定向力障碍、共济失调等。对于肾功能不全的患者、妊娠期和产褥期妇女用药患者，以及与其它抗癫痫药物进行合并用药的患者，及时监测血清中奥卡西平代谢物浓度从而及时调整治疗剂量是至关重要的。此外，由于奥卡西平会导致过敏、低血钠症、甲状腺功能异常和尿潴留等不良反应，因此在奥卡西平用药期间要对服用该药的患者进行严密观察，测定患者血清内药物浓度，及时发现不良反应并对症治疗，避免严重不良反应发生，保证用药安全。
[0004]奥卡西平代谢物的血药浓度检测方法有高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱
‑
串联质谱(HPLC
‑
MS)等。高效液相色谱法对临床癫痫患者进行血药浓度测定时，常用的抗癫痫药物丙戊酸、卡马西平和苯妥英钠对MHD的测定无干扰，特异性较好，灵敏度高，但其样品预处理过程复杂，时间长。液相色谱
‑
串联质谱同时测定人血浆中奥卡西平和MHD浓度，样品前处理血浆用量少，分析时间较短，但操作较繁琐，过程不易控制，不方便形成大规模临床检验。
[0005]因此，目前市面上缺乏线性范围宽、灵敏度高、准确度高、精密度高、检测时间短，样品处理简单，适用于全自动化检测仪器，可进行高通量、快速化检测的奥卡西平检测产品。

技术实现思路

[0006]为了克服现有技术的不足，本专利技术的第一个目的在于提供一种奥卡西平衍生物，该衍生物为新合成的化合物，自然界中不存在。
[0007]本专利技术的第一个目的采用以下技术方案实现：一种奥卡西平衍生物，其结构式如式Ⅰ所示：
式Ⅰ。
[0008]本专利技术的第二个目的在于提供一种如上所述的奥卡西平衍生物的合成方法，该合成方法不同于常规合成方法，具有良好的合成效果，显著提高了奥卡西平衍生物的合成效率。
[0009]本专利技术的第二个目的采用以下技术方案实现：一种如上述结构式Ⅰ所示的奥卡西平衍生物的合成方法，反应过程如下式所示：；具体的，反应过程包括以下步骤：（A1）化合物2的合成：称取2.5g的亚硝基二磺酸钾（弗里米盐（Fremy
’
s salt，(KSO3)2NO），9.32 mmol）和1.8 g Na2HPO4（12.7 mmol），放入烧杯中，加入95ml双蒸水溶解，调节pH至7.22；称取0.6 g化合物1（12.76 mmol）至60ml丙酮溶液中；将上述两种溶液混合，剧烈搅拌，得到紫色溶液；将上述紫色溶液加入到丙酮溶液中，持续搅拌10分钟，过滤，并置于冰箱中过夜；将过夜的溶液经氩气旋转蒸发仪浓缩，用500ml乙醚进行萃取，萃取完成后，将有机相溶剂蒸发；将蒸发残留物用键合硅胶柱进行快速柱层析纯化，洗脱剂为4∶1比例混合的己烷和氯化四乙铵（TEAC）溶液，最后经乙醚（Et2O）重结晶得到亚胺基苯醌化合物2。
[0010]（A2）化合物3的合成：
称取0.15g化合物2（5.8 mmol）溶解于50ml氯仿（CHCl3）中，将其置于分液漏斗中；称取2.5连二亚硫酸钠（Na2S2O4）（14.3 mmol）溶于20ml纯化水中制成溶液；在上述分液漏斗中加入过量的Na2S2O4溶液，轻轻振荡至有机溶液层的颜色由红色变为黄色，并静置分层；将水相用CHCl3进行萃取分离，得到的有机相再用Na2SO4进行吸水干燥，通过旋转蒸馏的方法将溶剂蒸发。经CHCl3萃取后的残留物进行重结晶得到化合物3。
[0011]（A3）化合物4的合成：称取0.14g的化合物3溶解于10 ml CHCl3中，再加入1ml的三乙胺（TEA）配制成溶液；向上述溶液中加入2 g 叔丁基二甲基氯硅烷（TBDMSCl）（15.2 mmol），于室温下搅拌3天，再将溶剂蒸发；加入纯化水溶解，用CHCl3进行萃取分离，得到的有机相用Na2SO4吸水干燥，通过旋转蒸馏的方法将溶剂蒸发，得到粗提化合物4。
[0012]（A4）化合物5的合成：称取0.16g的化合物4溶解于10 ml的CHCl3中，再加入2 ml腈基四甲基亚砜（TMSOCN）（4.95 mmol），于室温下搅拌2天，将溶剂蒸发；再加入纯化水溶解，用CHCl3萃取，得到的有机相先用盐水进行洗涤，再加入Na2SO4进行干燥，最后通过旋转蒸馏的方法将溶剂蒸发，得到粗提化合物5。
[0013]（A5）化合物6的合成：称取0.16g化合物5和2 g四丁基氟化铵（TBAF）（15.2 mmol）置于烧杯中，加入20 ml 四氢呋喃（THF）溶解，于室温下搅拌4小时后，将溶剂蒸发；再加入蒸馏水溶解，用丙烯酸乙酯（EA）萃取分离，得到的有机相用Na2SO4进行干燥，通过旋转蒸馏将溶剂蒸发；粗提物经过色谱柱（洗脱剂：EA/PE（丙烯酸乙酯/聚乙烯）=1:1）纯化后，得到化合物6。
[0014]（A6）化合物7的合成：
称取0.12g的化合物6（4.0 mmol）加入到30 ml的丙烯腈（ACN）中溶解，再加入1.38 g K2CO3（10.0 mmol）和1.16g化合物A（5
‑
溴正戊酸甲酯）（6.0 mmol），室温下搅拌过夜；溶液经真空抽滤方法浓缩，再用乙酸乙酯（EtOAc）萃取分离；得到的有机相加入Na2SO4进行干燥，再经抽真空过滤；粗提化合物用硅胶键合柱进行快速层析（洗脱剂：EA/PE（丙烯酸乙酯/聚乙烯本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种奥卡西平衍生物，其特征在于，其结构式如式Ⅰ所示：式Ⅰ。2.一种如权利要求1所述的奥卡西平衍生物的合成方法，其特征在于，所述合成方法的反应过程如下式所示：。3.一种奥卡西平免疫原，其特征在于，所述奥卡西平免疫原由权利要求1所述的奥卡西平衍生物与载体蛋白连接而成，其结构式如式Ⅱ所示：式Ⅱ；其中，载体蛋白为重组人血清白蛋白。4. 根据权利要求3所述的奥卡西平免疫原，其特征在于，所述重组人血清白蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。5.一种如权利要求3
‑
4任一项所述的奥卡西平免疫原的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：（B1）载体蛋白溶液的制备：将权利要求3
‑
4任一项中所述的重组人血清白蛋白溶解于磷酸盐缓冲液中，得到载体蛋白溶液；（B2）奥卡西平衍生物溶液的制备：将权利要求1所述的奥卡西平衍生物与二甲基甲酰胺、乙醇、磷酸钾缓冲液、1
‑
乙基
‑3‑
(
‑3‑
二甲氨丙基)碳二亚胺和N
‑
羟基硫代琥珀酰亚胺混合，搅拌溶解，得到奥卡西平衍生物溶液；（B3）奥卡西平免疫原的合成：将步骤（B2）得到的奥卡西平衍生物溶液加入到步骤（B1）得到的载体蛋白溶液中，搅拌反应，经透析纯化，得到奥卡西平免疫原。6.一种抗奥卡西平特异性抗体，其特征在于，所述抗奥卡西平特异性抗体为使用权利
要求3
‑
4任一项所述的奥卡西平免疫原对实验动物进行注射后所得到的特异性抗体，所述的实验动物为兔子、山羊、绵羊、小鼠、大鼠、豚鼠或马中的一种。7.一种如权利要求6所述的抗奥卡西平特异性抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包含以下步骤：（C1）将权利要求3
‑
4任一项所述的奥卡西平免疫原用磷酸盐缓冲液稀释，得到奥卡西平人工抗原溶液，然后将奥卡西平人工抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对权利要求6中所述的实验动物进行多点注射；（C2）3
‑
6周后，再用相同的奥卡西平人工抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合，对上述实验动物进行多点注射，之后每隔3
‑
6周注射一次，共计注射3
‑
10次；（C3）对步骤（C2）中完成注射的实验动物取血，分离纯化，得到抗奥卡西平特异性抗体。8.如权利要求6
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【专利技术属性】
技术研发人员：张小可，张韶斌，陈斯亮，
申请(专利权)人：苏州博源医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：