一种基于溴化衍生物的香草扁桃酸均相酶免疫检测试剂及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种基于溴化衍生物的香草扁桃酸均相酶免疫检测试剂及其制备方法。香草扁桃酸溴化衍生物及合成方法均为针对性的新研究与设计，以新研发的香草扁桃酸溴化衍生物制备得到的香草扁桃酸溴化衍生物免疫原，以该香草扁桃酸溴化衍生物免疫原免疫实验动物制备得到的抗香草扁桃酸特异性抗体与30种常见激素及激素代谢物无任何交叉反应。使用上述抗香草扁桃酸特异性抗体与香草扁桃酸溴化衍生物酶标偶联物制备得到的基于溴化衍生物的香草扁桃酸均相酶免疫检测试剂的检测灵敏度达到ng/mL级别，能准确检测生物样本中微量香草扁桃酸的浓度，其检测的准确性、精密度、灵敏度与特异性都显著高于现有技术。特异性都显著高于现有技术。特异性都显著高于现有技术。

【技术实现步骤摘要】
一种基于溴化衍生物的香草扁桃酸均相酶免疫检测试剂及其制备方法


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种基于溴化衍生物的香草扁桃酸均相酶免疫检测试剂及其制备方法。

技术介绍

[0002]香草扁桃酸（Vanillymandelic Acid，VMA），其结构式如式Ⅳ所示：式Ⅳ。
[0003]香草扁桃酸又称为3
‑
甲氧基
‑4‑
羟基苦杏仁酸（DL
‑3‑
Methoxy
‑4‑
hydroxymandelic acid，MHMA）或香草苦杏仁酸，是肾上腺髓质激素儿茶酚胺（CA）类物质的终末代谢产物，CA几乎全部在体内代谢，少部分的CA经单胺氧化酶作用，生成对
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二羟杏仁酸，大部分CA在CA
‑
O
‑
甲基转移酶作用下转变为3
‑
甲氧肾上腺素或去甲氧肾上腺素，最终代谢为3
‑
甲氧基
‑4‑
羟基苦杏仁酸。体内的CA代谢非常迅速，其代谢产物多由尿液排出。临床上24h尿中VMA的含量升高见于嗜铬细胞瘤、神经母细胞瘤、原发性高血压、心肌梗塞、慢性肾功能不全、甲状腺机能亢进或减退、肾上腺皮质功能不全、交感神经生理功能异常等。因此，测定24h尿中VMA的排出量对于上述疾病的临床诊断具有重要意义。
[0004]经典的VMA检测方法主要有：可见光分光光度法，此方法操作过程繁琐，精确度差；气象色谱法，此法对仪器要求比较高，操作复杂；高相液相
‑
电化学法，此方法易受仪器质量和工作环境的干扰，测定的灵敏度和专一性均需进一步提升；重氮法，此方法操作繁琐、可靠性低，回收率、重复性、稳定性还有待提高。以上测定方法都不能适应VMA临床检验的需要，目前市场上缺乏稳定性好、灵敏度高、特异性强的VMA检测试剂，尤其是能精确地测定生物样本中微量VMA含量的全自动化检测试剂。因此，研发一种质量达到临床检验要求、实用性强、性价比高，可应用于全自动生化分析仪的VMA检测试剂已成为本领域研究热点。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是：针对现有技术的上述缺陷，提供一种使用方便、灵敏度高、特异性强的基于溴化衍生物的香草扁桃酸均相酶免疫检测试剂及其制备方法。应
用该基于溴化衍生物的香草扁桃酸均相酶免疫检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对香草扁桃酸含量的全自动化测定，可以高通量、快速化、精确地测定生物样本中微量香草扁桃酸的含量，且具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，有效降低香草扁桃酸检测成本，有利于临床广泛推广使用。
[0006]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种基于溴化衍生物的基于溴化衍生物的香草扁桃酸均相酶免疫检测试剂，包括R1试剂和R2试剂，所述R1试剂中包含抗香草扁桃酸特异性抗体和均相酶底物溶液；所述R2试剂包含香草扁桃酸溴化衍生物酶标偶联物和R2缓冲液。
[0007]所述的抗香草扁桃酸特异性抗体，由香草扁桃酸溴化衍生物免疫原免疫实验动物后产生，所述实验动物为兔、山羊、绵羊、大鼠、小鼠、豚鼠或马中的一种；优选地，所述实验动物为兔。
[0008]所述的香草扁桃酸溴化衍生物免疫原由香草扁桃酸溴化衍生物与载体连接而成，其结构式如下述式（Ⅰ）所示：式（Ⅰ）；所述的载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽，选自血清蛋白、卵清蛋白、丙种球蛋白、甲状腺球蛋白、血蓝蛋白或多聚赖氨酸中的一种；优选地，所述的载体为血清蛋白；更优选地，所述的载体为牛血清白蛋白。
[0009]所述的香草扁桃酸溴化衍生物酶标偶联物由香草扁桃酸溴化衍生物与人工诱变葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶（mG6PDH）连接而成，其结构式如下述式（Ⅱ）所示：式（Ⅱ）。
[0010]式中mG6PDH为人工诱变葡萄糖
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磷酸脱氢酶，所述人工诱变葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：1；具体的，所述人工诱变葡萄糖
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磷酸脱氢酶的氨基酸序列（SEQ ID NO：1）如下所示：MGSAASLPPQATQVSFSKADFEELLHVVDTSQKNVKEALGKAGIALGEAPKQQPAPSAASICLEQEAWRSGKLSVTVLGATGCLAKKETFPALLDLFAHDYLQHEAVIVCFARKSMTTEDFRAYLSEALAKSHVCQCMPEVRDSIPAFLKKVHYCAGAYDSVEAMTELDKLLTVEEERFHLDDNDAPKKQSFRIFYFAIPPFVFQGAAKAIKEVAMAKDGSTRLIIEKPFGHDLTSAQELQECLSALFKEEEIYRMDHFLGYEICQNILSVRFGNQFLEPLMNNKHVAAVRVTLKECFGTEGRGGYFTKYGIIRDVIQNHLLQMLCLVAMERPGDMDWEADVRDRKVELLKAMEPFDPSSVVLGQYVGAKGKPGYLE
DDSITEADRDMAKKCPTFCQMVVRINNERWQCVNFIVRAGKAIDECKCEIRVQFKEAECCGKLFGEQYPARNELVLRVSPGEAIYMKMSVKSPGLSKQLMQSEMDLSYSVRYPGIYCPSAYTRLILAGIRGQSESFVRCDELMRSWELFTPFLEKIADWQPKPYPYGSRGPAVACEALELYGYQKPEGYCWRPPHQPPALTRLMTR所述的香草扁桃酸溴化衍生物，其结构式如下述式（Ⅲ）所示：式（Ⅲ）。
[0011]本专利技术所述的基于溴化衍生物的香草扁桃酸均相酶免疫检测试剂，制备方法包括以下步骤：（S1.1）R1试剂的制备：将质量分数6.0%的氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、6.0%的葡萄糖
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磷酸、0.3%的牛血清白蛋白、0.03%的NaN3的用浓度为60 mmol/L、pH=7.8的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物溶液；再将抗香草扁桃酸特异性抗体加入所述均相酶底物溶液中混匀，得到R1试剂，所述抗香草扁桃酸特异性抗体与均相酶底物溶液的体积比为1∶50～1∶5000。优选地，所述抗香草扁桃酸特异性抗体与均相酶底物溶液的体积比为1∶625。
[0012]（S1.2）R2试剂的制备：将质量分数0.3%的牛血清白蛋白、0.03%的NaN3用浓度为150 mmol/L、pH=8.0的Tris缓冲液溶解制成R2缓冲液，再将香草扁桃酸溴化衍生物酶标偶联物加入所述R2缓冲液中混匀，得到R2试剂，所述香草扁桃酸溴化衍生物酶标偶联物与R2缓冲液的体积比为1∶50～1∶5000。优选地，所述香草扁桃酸溴化衍生物酶标偶联物与R2缓冲液的体积比为1∶1250。
[0013]其中，所述抗香草扁桃酸特异性抗体的制备方法，包括以下步骤：（S2.1）用浓度为10 mmol/L、pH=7.4的PBS缓冲液将香草扁桃酸溴化衍生物免疫原稀释至8.0 mg/ml本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于溴化衍生物的香草扁桃酸均相酶免疫检测试剂，其特征在于，包括R1试剂和R2试剂，所述R1试剂中包含抗香草扁桃酸特异性抗体和均相酶底物溶液；所述R2试剂包含香草扁桃酸溴化衍生物酶标偶联物和R2缓冲液；所述的抗香草扁桃酸特异性抗体，由香草扁桃酸溴化衍生物免疫原免疫实验动物后产生，所述实验动物为兔、山羊、绵羊、大鼠、小鼠、豚鼠或马中的一种；所述的香草扁桃酸溴化衍生物免疫原由香草扁桃酸溴化衍生物与载体连接而成，其结构式如下述式（Ⅰ）所示：式（Ⅰ）；所述的载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽，选自血清蛋白、卵清蛋白、丙种球蛋白、甲状腺球蛋白、血蓝蛋白或多聚赖氨酸中的一种；所述的香草扁桃酸溴化衍生物酶标偶联物由香草扁桃酸溴化衍生物与人工诱变葡萄糖
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磷酸脱氢酶连接而成，其结构式如下述式（Ⅱ）所示：式（Ⅱ）；式中mG6PDH为人工诱变葡萄糖
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磷酸脱氢酶，所述人工诱变葡萄糖
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磷酸脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：1；所述的香草扁桃酸溴化衍生物，其结构式如下述式（Ⅲ）所示：式（Ⅲ）。2.根据权利要求1所述的基于溴化衍生物的香草扁桃酸均相酶免疫检测试剂，其特征在于，所述实验动物为兔。3.根据权利要求1所述的基于溴化衍生物的香草扁桃酸均相酶免疫检测试剂，其特征在于，所述的载体为血清蛋白。4.根据权利要求3所述的基于溴化衍生物的香草扁桃酸均相酶免疫检测试剂，其特征在于，所述的载体为牛血清白蛋白。5.根据权利要求1所述的基于溴化衍生物的香草扁桃酸均相酶免疫检测试剂，其特征在于，制备方法包括以下步骤：
（S1.1）R1试剂的制备：将质量分数6.0%的氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、6.0%的葡萄糖
‑6‑
磷酸、0.3%的牛血清白蛋白、0.03%的NaN3的用浓度为60 mmol/L、pH=7.8的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物溶液；再将抗香草扁桃酸特异性抗体加入所述均相酶底物溶液中混匀，得到R1试剂，所述抗香草扁桃酸特异性抗体与均相酶底物溶液的体积比为1∶50～1∶5000；（S1.2）R2试剂的制备：将质量分数0.3%的牛血清白蛋白、0.03%的NaN3用浓度为150 mmol/L、pH=8.0的Tris缓冲液溶解制成R2缓冲液，再将香草扁桃酸溴化衍生物酶标偶联物加入所述R2缓冲液中混匀，得到R2试剂，所述香草扁桃酸溴化衍生物酶标偶联物与R2缓冲液的体积比为1∶50～1∶5000。6.根据权利要求5所述的基于溴化衍生物的香草扁桃酸均相酶免疫检测试剂，其特征在于，所述抗香草扁桃酸特异性抗体与均相酶底物溶液的体积比为1∶625；所述香草扁桃酸溴化衍生物酶标偶联物与R2缓冲液的体积比为1∶1250。7.根据权利要求1所述的基于溴化衍生物的香草扁桃酸均相酶免疫检测试剂，其特征在于，所述抗香草扁桃酸特异性抗体的制备方法，包括以下步骤：（S2.1）用浓度为10 mmol/L、pH=7.4的PBS缓冲液将香草扁桃酸溴化衍生物免疫原稀释至8.0 mg/ml，得到人工抗原溶液，然后将5.0 ml所述人工抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物进行注射；（S2.2）...

【专利技术属性】
技术研发人员：虞留明，李冬，蔡江丽，余琳，
申请(专利权)人：苏州博源医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：