嵌合IBV 4/91株纤突蛋白膜外区基因片段的重组传染性支气管炎病毒及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种嵌合IBV4/91株纤突蛋白膜外区基因片段的重组传染性支气管炎病毒及其构建方法和应用。本发明专利技术的重组病毒是通过以下方法构建得到：将适应细胞培养的骨架病毒IBV?Beaudette毒株的纤突蛋白膜外区基因片段置换成IBV4/91株的纤突蛋白膜外区基因片段来构建重组病毒，经病毒拯救过程后在Vero细胞上盲传3-5代，直至特定细胞病变—合胞体现象出现，即获得了嵌合IBV4/91株纤突蛋白膜外区基因片段的重组传染性支气管炎病毒。将本发明专利技术构建得到的重组传染性支气管炎病毒接种鸡只后表明，本发明专利技术重组病毒不仅对各种鸡只均安全、无副反应，而且能够诱导接种鸡只产生抵抗野生型毒株49/1攻击的免疫力。

【技术实现步骤摘要】
嵌合IBV 4/91株纤突蛋白膜外区基因片段的重组传染性支气管炎病毒及其构建方法和应用
本专利技术涉及一种重组传染性支气管炎病毒及其鉴定方法，特别涉及一种嵌合IBV4/91株纤突蛋白膜外区基因片段的重组传染性支气管炎病毒及其构建方法和应用，本专利技术属于兽医微生物研究
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技术介绍
鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis, IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Avian Infectious Bronchitis Virus, IBV)引起的一种急性、高度接触性传染病。IBV为单股正链RNA病毒，属于冠状病毒科(Coronaviridae)。IBV对不同日龄的鸡均可感染，但感染主要侵害4周龄以下的雏鸡，临床以病鸡气管啰音、咳嗽、打喷嚏；肾脏苍白肿大、有大量尿酸盐沉积以及输卵管充血为主要特征，并可引起死亡，随鸡日龄的增长其抵抗力逐渐提高。该病自20世纪30年代在美国爆发以来，目前已成为世界性流行的主要禽病之一，对养鸡业造成了极大危害，它不仅可造成鸡的生长缓慢，而且容易导致继发感染，在伴有支原体和大肠杆菌混合感染时，该病表现得更为严重。近些年来，随着养殖规模的不断扩大，本病的流行呈上升趋势，造成了严重的经济损失，已成为继禽流感和新城疫之后危害养鸡业健康发展的重要传染病。IBV基因组可由于点突变和基因重组而发生变异，因此IBV血清型较多。已知的血清型有以侵害呼吸道为主的Conn、Florida、M41、1wa97等和以侵害肾脏为主的Holte、Australia T、Gray等。1991年英国发现了一种新的血清型的IBV---4/91,该毒株可引起鸡的肌肉损伤和蛋鸡产蛋率的下降。同时，IBV4/91毒株和其它血清型IBV毒株之间无交叉血清学反应，其免疫原基因SI的序列与欧洲17个IBV毒株之间差异高达21%-25%。目前，该血清型IBV在西班牙、德国、荷兰、意大利、泰国、中国等国均有发生和流行，对养鸡业危害较大。常用的Massachusetts型疫苗(H120、MA5等)对IBV4/91无免疫保护作用，只有使用同源毒株的疫苗进行免疫预防才能取得较好的效果。英特威公司虽然已研制出的IB4/91疫苗，能够对免疫鸡群提供 一定的免疫保护力，但是新的变异株还在不断出现，为传染性支气管炎疫苗的研究提出了新的挑战。本专利技术用IBV4/91毒株的纤突蛋白膜外区基因片段置换IBV Beaudette P65代毒株的纤突蛋白膜外区基因片段来构建重组病毒，为研制可防控新变异株流行的应急疫苗提供方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服IB疫苗研制过程中需要耗时耗力分离纯化病毒、连续传代致弱病毒的不确定及毒力返强等问题以及疫苗生产过程中存在的外源病毒污染的风险、成本高、产毒量小、生产周期长等缺点，将IBV4/91毒株的纤突蛋白膜外区基因片段置换IBV Beaudette P65代毒株相应基因区段，进而构建重组病毒BeauR-4/91 (SI)。此外，本专利技术还提供了一种用于构建重组传染性支气管炎病毒的方法。本专利技术所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的:本专利技术的一种嵌合IBV4/91株纤突蛋白膜外区基因片段的重组传染性支气管炎病毒，其特征在于通过以下方法构建得到:用传染性支气管炎病毒4/91株(IBV4/91)的纤突蛋白膜外区基因片段置换适应VeiO细胞培养的传染性支气管炎病毒Beaudette (IBVBeaudette)毒株的纤突蛋白膜外区基因片段来构建重组病毒，经病毒拯救过程后在VeiO细胞上盲传3-5代，直至特定细胞病变一合胞体现象出现，即获得了嵌合IBV4/91株纤突蛋白膜外区基因片段的重组传染性支气管炎病毒。在本专利技术中，优选的，所述的重组传染性支气管炎病毒，其特征在于所述的禽传染性支气管炎病毒Beaudette毒株为适应Vero细胞培养的禽传染性支气管炎病毒Beaudette毒株的 p65 代毒，即 Beaudette (p65)。 在本专利技术中，所述的传染性支气管炎病毒4/91株，记载于“鸡传染性支气管炎病毒M41、4/91及疫苗株Ma5、H52、H120N基因的克隆与序列分析” 一文中，作者亓丽红，马秀丽等，发表于《家禽科学》期刊上，所述IBV4/91株可购买自中国兽医药品监察所。在本专利技术中，所述的适应Vero细胞培养的IBV Beaudette毒株(Verocell-adapted IBV Beaudette strain)记载在文献:An arginine-to-proline mutationin a domain with undefined functions within the helicase protein(Nspl3)islethal to the coronavirus infectious bronchitis virus in cultured cells,ShouguoFang, et al., Virology358(2007) 136-147 中。在本专利技术的一个具体实施例中，所述的适应Vero细胞培养的IBV Beaudette毒株为 IBV Beaudette 毒株的 p65 代毒(Vero cell-adapted IBV strain Beaudette (p65)),其 GenBank 号为 DQ001339.1。记载在文献:The Cellular RNA Helicase DDXlInteractswith Coronavirus Nonstructural Proteinl4and Enhances Viral Replication,LinghuiXu et al, JOURNAL OF VIROLOGY, S印t.2010，p.8571 - 8583 中，现由中国农业科学院兰州兽医研究所保存，提供。在本专利技术中，优选的，所述的传染性支气管炎病毒4/91株的纤突蛋白膜外区基因片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述的传染性支气管炎病毒Beaudette毒株的纤突蛋白膜外区基因片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。在本专利技术的一个具体实施例中，本专利技术的一种嵌合IBV4/91株纤突蛋白膜外区基因片段的重组传染性支气管炎病毒，命名为BeauR-4/91 (SI)，分类命名为鸡传染性支气管炎病毒，其为病毒拯救成功后在Vero细胞上传代的第15代细胞毒，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，其微生物保藏编号为=CGMCC N0.7102，保藏时间为2013年I月18日。本专利技术重组传染性支气管炎病毒BeauR-4/91 (SI)的形态学观察:重组病毒BeauR-4/91 (SI)由TCID5tl稳定的细胞毒扩大培养所得，经低温(4°C )高速离心、磷钨酸负染后在电镜下可看到直径约为80-120nm的病毒粒子，呈多形性，多数为圆形，有囊膜，表面有松散的均匀分布的冠状突起。此外，本专利技术还公开了一种以上任一项所述的重组传染性支气管炎病毒的方法，其特征在于包括以下步骤:(I)分别从IBV4/91毒株和适应Vero细胞培养的IBV Beaudette本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种嵌合IBV4/91株纤突蛋白膜外区基因片段的重组传染性支气管炎病毒，其特征在于通过以下方法构建得到：用传染性支气管炎病毒4/91株（IBV4/91）的纤突蛋白膜外区基因片段置换适应Vero细胞培养的传染性支气管炎病毒Beaudette（IBV?Beaudette）毒株的纤突蛋白膜外区基因片段来构建重组病毒，经病毒拯救过程后在Vero细胞上盲传3?5代，直至特定细胞病变—合胞体现象出现，即获得了嵌合IBV4/91株纤突蛋白膜外区基因片段的重组传染性支气管炎病毒。

【技术特征摘要】
1.一种嵌合IBV4/91株纤突蛋白膜外区基因片段的重组传染性支气管炎病毒，其特征在于通过以下方法构建得到:用传染性支气管炎病毒4/91株(IBV4/91)的纤突蛋白膜外区基因片段置换适应Vero细胞培养的传染性支气管炎病毒Beaudette (IBV Beaudette)毒株的纤突蛋白膜外区基因片段来构建重组病毒，经病毒拯救过程后在Vero细胞上盲传3-5代，直至特定细胞病变一合胞体现象出现，即获得了嵌合IBV4/91株纤突蛋白膜外区基因片段的重组传染性支气管炎病毒。2.如权利要求1所述的重组传染性支气管炎病毒，其特征在于所述的禽传染性支气管炎病毒Beaudette毒株为适应VeiO细胞培养的禽传染性支气管炎病毒Beaudette毒株的p65代毒。3.如权利要求1或2所述的重组传染性支气管炎病毒，其特征在于所述的传染性支气管炎病毒4/91株的纤突蛋白膜外区基因片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述的传染性支气管炎病毒Beaudette毒株的纤突蛋白膜外区基因片段的核苷酸序列如SEQ IDN0.3所示。4.如权利要求1-3任一项所述的重组传染性支气管炎病毒，其特征在于所述的重组病毒命名为BeauR-4/91 (SI)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为:CGMCC N0.7102。5.一种构建权利要求1-4任一项所述的重组传染性支气管炎病毒的方法，其特征在于包括以下步骤: (I)分别从IBV4/91毒株和适应Vero细胞培养的IBV Beaudette p65代毒株中提取总RNA，用以下引物进行反转录，其中引物Beau-21710R用于IBV4/91株纤突蛋白膜外区基因片段的反转录，引物 Beau-5752R、Beau_8693R、Beau_15520R、Beau_20422R、Beau_27608R用于亲本病毒Beaudette p65代毒株骨架片段的反转录；T7-leading5-GGCTAGCTAATACGACTCACTATAGGACTTAAGATAGATATTAATA-3headBeau-5752R5-CATGCGGTCTCGCGACAACACTCTTAAC~3Beau-5749F5-GTATCCGTCTCTGTCGCTAGCTATAAGACCG~3Beau-8693R5-TCACGTCTCGGCCTCAAATTTATCACCTATC~3Beau-8690F5-CGTACGTCTCGAGGCCTACCTTTCAGCG~3Beau-15520R5-GCTAATCGTCTCAATGAATCAC~3Beau-15510F5-GCAGTGATTCATTGAGACGTATACG~3Beau-20422R 5~GAGGTCTCACAGCACTACATAGTGCAC~3Beau-20419F 5~GTGGTCTCTGCTTTGCTTTATGATAAAAATAC~3Beau-2I71OR 5~ATGGTCTCGTACATTAGTAATAAAACC~3Beau-2I707F 5~AGGGTCTCAATGTGACCGACTCAGCTG~3Beau-2760 8R 5-GAGGTCTCG(T) 3JGCTCTAACTCTATACTAGC-3Beau-5752R 5~CATGCGGTCTCGCGACAACACTCTTAAC~3Beau-8693R 5~TCACGTCTCGGCCTCAAATTTATCACCTATC~3Beau-15520R 5-GCTAATCGTCTCAATGAATCAC-3Beau-20422R 5~GAGGTCTCACAGCACTACATAGTGCAC~3Beau-2I71OR 5~ATGGTCTCGTACATTAGTAATAAAACC~3Beau-27608R 5-GAGGTCTCG(T) 3JGCTCTAACTCTATACTAGC-3 (2)利用引物对Beau-20419F和Beau_21710R扩增IBV4/91株纤突蛋白膜外区基因片段，所得片段标记为4/91 (Sle)，利用其它5对引物扩增IBV Beaudette P65代毒的骨...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭慧琛，孙世琪，魏衍全，董虎，王海民，孙德惠，刘定祥，方守国，才学鹏，殷宏，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：