本发明专利技术涉及富含α-延伸的血纤蛋白原的血纤蛋白原制备物。包含这种制备物的组合物与基于HMW?Fib的制备物相比示出改良的凝血性质，后者典型地不含有或仅含有少量α-延伸的血纤蛋白原。特别地，由α-延伸的血纤蛋白原产生的血凝块的形成时间和血凝块强度得以改良。此外，与血浆衍生的血纤蛋白原相比，α-延伸的血纤蛋白原的纤溶酶介导的降解降低。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及血纤蛋白原制备物及血纤蛋白原制备物在医学中的应用。特别地，本专利技术涉及富含具有延 伸的α链的血纤蛋白原的血纤蛋白原制备物，及涉及产生这种制备物的方法及其应用。
技术介绍
血纤蛋白原(f ibrinogen)是ー种可溶的血楽;糖蛋白，其在人体内主要由肝实质细胞合成。其是ニ聚体分子，由通过ニ硫键连接的两对三个称作Αα、Ββ和Y的多肽链组成。所述三条多肽链由三个单独的基因编码。主要存在形式(HMW fib)携带Aa链，其作为625个氨基酸的前体合成，作为610个氨基酸的多肽链存在于在血浆中发现的血纤蛋白原中，B β链含有461个氨基酸，Y链含有411个氨基酸。所述三条多肽链从3个mRNA中单独地合成。三条成分链(Aa、Ββ和Y)装配成作为六条链的ニ聚体(Aa、Ββ，Υ)2的最終形式，该装配在内质网(ER)的腔隙中发生。血纤蛋白原在血液中以高浓度(l_2g/L)循环，并且表现为高度的异质性。据估计在每个个体中有大约ー百万个不同的血纤蛋白原分子循环。仅占总血纤蛋白原的一小部分(在大多数情况中不超过几个百分数)的这些变体中的大多数在功能和结构方面不同。Aa链的羧基末端部分的蛋白酶解产生三种主要循环形式的血纤蛋白原，其具有明显不同的分子量。血纤蛋白原以高分子量形式合成(HMW，分子量340kDa;循环中的主要形式的Aa链含有610个氨基酸)。一条A a链的降解产生LMW形式(MW=305kDa) ;LMW’形式(270kDa)是变体，其中两条Aa链在羧基末端被部分降解。在健康个体的血液中，50_70%的血纤蛋白原是HMW，20-50%是具有一或两条降解的Aa链的血纤蛋白原(de Maat andVerschuur (2005) Curr. Opin. Hematol. 12,377)。所述 HMW 和 LMW’ 变体不出不同的凝血时间和血纤蛋白多聚体结构(Hasegawa N, Sasaki S. (1990)Thromb. Res. 57，183)。熟知的可变剪接变体是所谓的gamma prime(Y’)变体和a-ext Fib或Fib420变体。所述α-ext Fib或Fib420变体的分子量为420kDa，占总循环血纤蛋白原的1-3%(de Maat and Verschuur (2005) Curr. Opin. Hematol. 12, 377) 延伸的 a -ext Fib 同种型与常规的血纤蛋白原α -链不同，其由于可变剪接而存在额外的236个残基的C末端球形结构域。在文献中给出了关于Fib420的功能和特性的矛盾数据。基于对血浆衍生的a -ext Fib 的研究，Applegate et al, Blood (2000) 95:2297 推断 α-ext Fib 的聚合和交联性质与血浆衍生的HMWFib无明显不同。他们的结论是所述额外的C-结构域对于凝血无作用，并提示所述结构域的功能也许支持整联蛋白介导的细胞粘附。在EP I 495 051中，提示Fib420可能对降解较不敏感，及对血凝块结构可能有作用。然而，未进行证实及未提示该作用在血凝块结构或强度中可能是增强或是降低。Mosesson et al. (Biophys.Chem. 112，209:2004)基于脐带血浆衍生的a -extFib研究了血凝块的超微结构。他们报道了 α-ext Fib血凝块的纤维比基于HMW血纤蛋白原的那些纤维更细及更多分支，但是其具有所有血纤蛋白纤维特有的相同周期性。所述作者提示α-ext Fib中延伸的α-链提供与细胞整联蛋白相互作用的位点的功能。详细描述本专利技术涉及血纤蛋白原制备物，其含有至少95%(w/w)的血纤蛋白原，并且其中至少10%的血纤蛋白原是Fib420形式。在本领域中，Fib420也称作“ a -ext Fib”、“具有延伸的α -链的血纤蛋白原”或者“血纤蛋白原·”。在本专利技术中，这些术语可互換使用。所有这些术语均是指所述结构(Ααεχ ,Ββ , Y)的对称分子，其中如在HMW fib中发现的两条常规血纤蛋白原α-链由延伸的α链置換。 在本专利技术中，术语“血纤蛋白原制备物”是指分离形式的血纤蛋白原，例如血纤蛋白原的血浆分离物或者细胞上清分离物。其也可以是指合成的血纤蛋白原制备物。本专利技术的血纤蛋白原制备物优选含有基于总蛋白质的至少65%w/w、至少70%>w/w、至少75%w/w、至少80%w/w或者至少85%的血纤蛋白原。更优选地，其是纯的制备物，其中基本上没有污染物如其它蛋白质存在，其含有基于总蛋白质的至少90%w/w、至少95%w/w、至少96%w/w、至少97%w/w或者至少98%的血纤蛋白原。更优选地，本专利技术的血纤蛋白原制备物包含基于总蛋白质的至少99%w/w或者至少99. 5%w/w的血纤蛋白原。这种纯血纤蛋白原制备物特别适合配制用于医学应用中的组合物，如用于伤ロ治疗和手术修复的组合物。根据本专利技术，所述制备物中至少10%的血纤蛋白原是Fib420形式。优选地，至少15%w/w、至少20%w/w、至少25%w/w或者至少30%w/w的血纤蛋白原是Fib420形式。更优选地，至少40%w/w、至少50%w/w、至少60%w/w、至少70%w/w、至少80%w/w或者至少90%w/w是Fib420形式。最优选地，至少95%w/w、至少99%w/w或者所有血纤蛋白原均是Fib420形式。本专利技术的血纤蛋白原制备物的一个优势是血纤蛋白原制备物的纤溶酶介导的消化慢于血浆衍生的血纤蛋白原。其对于纤溶酶消化的增强的抗性可有益于治疗患有血纤蛋白溶解亢进的患者，通常见于获得性凝血功能障碍情况中。使用本专利技术的血纤蛋白原制备物，血凝块较快速地形成，并且形成的血凝块与血浆衍生的血纤蛋白原或HMW血纤蛋白原形成的血凝块相比具有更高的血凝块坚固性(firmness)。这意味着当使用本专利技术的血纤蛋白原制备物时，血纤蛋白血凝块稳定性增强，本专利技术的血纤蛋白原制备物与现有制备物相比更强效。更强效的血纤蛋白原制备物使得给予的液体量和治疗性蛋白质的量均降低。这对于静脉内使用以治疗稀释性凝血功能障碍是有利的。目前对于静脉内(i. V)注射血纤蛋白原以补偿低凝血活性，需要高剂量的血纤蛋白原(毎次治疗、g血纤蛋白原)。这是通过直接注射70mg/kg剂量给予的。由于血纤蛋白原通常在20mg/ml最大浓度可以被溶解,这意味着需要静脉内给予成人大约250ml液体。通过提供更强效的血纤蛋白原以降低整个剂量是有益的。另ー优势是使用本专利技术的血纤蛋白原制备物与使用血浆衍生的血纤蛋白原或HMW血纤蛋白原的制备物相比导致的血凝块形成对因子XIII的依赖性降低。在缓冲液中由α-延伸的Fib (不存在因子XIII)形成的血凝块的强度高于含有ー些因子XIII的血浆衍生的血纤蛋白原形成的血凝块的强度。不需要因子XIII以形成坚实的血凝块。因此，在一个实施方案中，本专利技术的血纤蛋白原制备物没有因子XIII。使用ROTEM分析可以测量a -ext rhFib和血衆衍生的血纤蛋白原的凝血时间(CT)、血凝块形成时间(CFT)和血凝块坚固性。ROTEM (PentapharmGmbH, Munich, Germany)表不 Rotati本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.01.08 EP 10150391.01.血纤蛋白原制备物，其在ROTEM 凝血弾性描记法检测中在相似条件下具有低于血浆衍生的血纤蛋白原制备物的血凝块形成时间的血凝块形成时间。2.权利要求I的血纤蛋白原制备物，其含有至少95%(w/w)的血纤蛋白原，且其中至少10%(w/w)的血纤蛋白原是Fib420形式。3.权利要求I或2的血纤蛋白原制备物，其没有因子XIII。4.包含权利要求1-3的血纤蛋白原制备物及药物可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。5.权利要求4的药物组合物，其中所述组合物适于促进组织粘附、改良伤ロ愈合或者适于静脉内给予。6.权利要求4或5的药物组合物，其中所述药物组合物是血纤蛋白密封剂或者局部止血剂。7.权利要求4-6的药物组合物，其进ー步包含凝血酶。8.权利要求4-7的药物组合物，其是干燥形式。9.权利要求1-3的血纤蛋白原...
【专利技术属性】
技术研发人员：J·格林伯格，J·库普曼，A·伯特，
申请(专利权)人：普罗菲布瑞克斯公司，
类型：发明
国别省市：
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