链激酶突变体及其共价修饰形式制造技术

本发明专利技术涉及链激酶的新的突变体、其功能片段和共价修饰形式。提供制备细菌纤溶酶原激活物蛋白链激酶、其突变蛋白、物种变体和它们的共价修饰变体的方法，它们的特征是改进的治疗性质，如增加的蛋白水解稳定性、延长的血浆半寿期、降低的免疫反应性和增强的血纤蛋白凝块特异性。所述方法涉及向蛋白质的非必需区中掺入额外的半胱氨酸残基或者用半胱氨酸残基取代天然存在的氨基酸，使得所得蛋白质的催化活性保持大部分不变。这些半胱氨酸变体通过共价连接半胱氨酸反应性聚合物如聚乙二醇(PEG)或者来自包括荧光团、自旋标记物或者其他小缀合物的基团的巯基反应性结构部分进行进一步修饰。本文公开了链激酶和其共价修饰变体的位点特异性生物活性缀合物。

【技术实现步骤摘要】
链激酶突变体及其共价修饰形式本申请是国际申请号PCT/IN2009/000212，国际申请日2009年3月31日，进入中国国家阶段日期为2010年11月30日，中国申请号200980120111.3，专利技术名称为“链激酶突变体及其共价修饰形式”的分案申请。专利
本专利技术涉及链激酶突变体及其共价修饰形式。本专利技术利用链激酶和其具有取代、添加、缺失的相关变体或结构域融合构建体的同质的、位点特异的和确定的PEG修饰来允许它们以改进的蛋白质治疗剂的形式应用。本专利技术涉及使用硫羟反应性PEG试剂将PEG共价连接到链激酶的半胱氨酸变体、链激酶的突变蛋白、物种变体或血纤蛋白融合产物。还可以利用α胺基的不同PKa值在酸性PH下实施α胺特异性PEG缀合以产生链激酶或其突变蛋白的单-PEG化衍生物。本专利技术还涉及基于结构和功能信息鉴定链激酶的多种半胱氨酸变体，或其突变体，包括相关的共价变体(Wang等，1998)。其他单结构域纤溶酶原激活物葡萄球菌激酶(SAK)的结构比较显示出与SKa结构域的强烈相似性，尽管这两种酶在氨基酸水平上没有显著的序列相似性(Rabijns等，1997)。这表明来自不同来源的纤溶酶原激活物尽管它们的多肽序列非常不同，但是仍然保留了相同的结构折叠。预期其受到进化限制来保持结构完整性，因为细菌纤溶酶原激活物是蛋白质辅因子，因此利用酶原的构象激活所需的多个接触点。此类结构相似性进一步延伸了本专利技术的范围，因为本案中实施的方法可以应用于来自其他属或种的具有相似的纤溶酶原激活结构域的细菌纤溶酶原激活物。为此，本文中公开的用于产生链激酶的生物活性半胱氨酸变体的“规则”将可以用于产生多种其他形式链激酶的生物活性的半胱氨酸变体。这些半胱氨酸变体与半胱氨酸反应性PEG的缀合将赋予与本研究中所用的变体所得的益处相似的益处。确定半胱氨酸放置位点的规则很大程度上基于从表面暴露的残基进行选择这一想法，所述表面暴露的残基落入环或螺旋或片层中或者在结构和柔性区的 边界中。为了确定表面可及性，使用DSSP程序。DSSP(Kabsch等，1983)程序确定了蛋白质的二级结构、几何特征和溶剂暴露，以蛋白质数据库(ProteinData Bank)形式给出原子坐标。DSSP以平方埃描述每个残基的暴露。从微纤溶酶复合体中链激酶的高分辨率晶体结构译解链激酶氨基酸残基的表面可及性(Wang等1998，PDBID1BML)。对于在该结构中缺失的区域(175-181和252-262)，分离的β结构域的晶体结构域(Wang等，1999，H)BIDlc4p)用于确定表面暴露。将链激酶的半胱氨酸变体、其突变蛋白、物种变体和其共价修饰形式通过连接巯基反应试剂进一步化学修饰，接着根据经验测试生物活性的实质性保留以及新性质的获得，所述新性质如降低的免疫原性，或者与抗SK抗体的反应、降低的蛋白水解敏感性、增加的体内存活等等。更具体地，本专利技术涉及生产工程化的链激酶衍生物用于治疗循环系统病症的药物组合物中。专利技术背景循环系统中血栓(血块)发展可以引起血管阻塞，导致致命的状况。凝块的产生和其溶解是高度受控的止血过程。正常止血的任何偏差都导致多种临床状况，如中风、肺栓塞、深静脉血栓形成和急性心肌梗死。止血失败所引起的病理生理学状况需要迅速的临床注意。此类病例的最常用的医学干预是静脉内施用血栓溶解剂(Collen等，1988 ;Collen，1990 ； Franc is和Marder，1991)。最常用的血栓溶解剂包括链激酶(SK)、尿激酶(UK)和组织型纤溶酶原激活物(tPA)。在过去已经进行了急性心肌梗死处理中使用不同的溶栓剂的多种药物经济学评估(Mucklow, 1995 ；Gillis和Goa, 1996)。Banerjee等，2004,已经论述了链激酶的临床有用性和其作为选用药的适用性。就临床效果而言，链激酶和tPA几乎同样好，但是由于相差几倍的低成本和稍长的体内半寿期，链激酶是世界上最优选的溶血栓药(Sherry和Marder, 1991, Wu等，1998)。而且，tPA的使用稍微更可能引起中风,其是两种药物的主要副作用。然而，链激酶是一种细菌蛋白质，本质上是抗原性的，并且可以引起临床并发症，如过敏反应或者出血。而且，链激酶的循环半寿期(15-30分钟)不足以有效溶栓(Wu 等，1998)。尽管存在这些问题，但是近年来，用溶血纤蛋白药如链激酶(SK)、组织纤溶酶原激活物(TPA)或尿激酶(UK)的溶栓疗法已经彻底改变了多种循环系统疾病如深静脉血栓形成、肺栓塞和心肌梗死的临床处理。这些药物通过切割纤溶酶原(PG)中残基561和562之间易断裂的肽键活化循环系统中的纤溶酶原(PG)而发挥其溶解血纤蛋白的效果。结果，无活性的酶原被转化成其活性形式:丝氨酸蛋白酶纤溶酶(PN)，其然后在系统中循环并作用于血纤蛋白以将其降解成可溶的降解产物。在这里可提及的是PN，其自身不能将PG活化成PN ;该反应被高度特异性蛋白酶像TPA、SK-纤溶酶原复合体和UK催化，所有这些蛋白酶都具有异常窄的蛋白质底物偏好性，即倾向于以高度位点特异性方式切割PG中易断裂的肽键。然而，不像UK和TPA，SK自身没有蛋白水解活性，并且它“间接”将PG活化为PN，即通过首先与PG形成高亲和力等摩尔复合体，这称作激活物复合体(Castellino，F.J.，1981综述)。该激活物复合体然后作为蛋白酶将PG的其他底物分子切割为PN。尽管在链激酶和其他细菌溶栓剂的治疗应用中取得了巨大的发展，但是仍然有一些缺点限制了这些多肽药物的有用性。这些缺点包括它们对蛋白水解酶降解的敏感性、短的循环半寿期、短的保存期、快速肾清除率和它们产生中和性抗体的倾向性。这些缺点有时也是非人源的许多其他多肽药物所固有的。这方面一般由Roberts等；2002综述。进行了多种尝试来克服多肽药物中的这些缺点，如改变氨基酸序列以减少蛋白酶解或抗原性，将多肽与球蛋白或白蛋白结构域融合以提高半寿期等等(Osborn等.2002)。这些方法对该问题提供了很少帮助并且带来了相关的负担。该领域的主要突破是蛋白质PEG化方法，其对多个问题提供了一种解决方法。通过将乙二醇的许多重复亚基聚合形成PEG(聚乙二醇)，产生具有定制的分子量的线性或分枝的PEG聚合物。一旦用PEG共价缀合，蛋白质或多肽就显示出改善的药代动力学和药效学性质，如增加的水溶性、降低的肾清除率和通常充分有限的免疫反应性(Moreadith等.2003，Doherty等，2005，Basu等，2006)。PEG缀合也使得分子对蛋白水解敏感性降低。PEG加入后降低的受体相互作用或降低的与细胞表面蛋白质的相互作用也帮助减少不利的免疫学作用。PEG化的药物在宽范围的pH和温度改变下更稳定(Monfardini等1995)。PEG的使用被FDA批准用于治疗剂并且其显示出几乎没有毒性并且被肾脏从身体完整除去或者在粪便中排出。PEG缀合的有益特征可以被潜在赋予SK使得其成为更有效和更安全的溶血栓药。在文献中报导了使用相对非特异性化学修饰反应进行SK PEG化的尝试(Rajagopalan等，1985)。此类修饰的治疗用途受到高度受损的纤溶酶原活化能力的严重限制。而且，修饰的性质的确定本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多肽，所述多肽包含选自由SEQ?ID?NO：22?24组成的组的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
2008.03.31 IN 837/DEL/20081. 一种多肽，所述多肽包含选自由SEQ ID NO:22-24组成的组的氨基酸序列。2.一种药物组合物，所述药物组合物包含具有选自由SEQ ID NO:22-24组成的组的氨基酸序列的多肽。3.一种治疗血栓形成的方法，所述方法包括具有选自由SEQ ID NO:22-24组成的组的氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢卡尔·库马，尼拉·马赫什瓦里，吉里什·萨尼，
申请(专利权)人：科学与工业研究委员会，
类型：发明
国别省市：