一种新型 GLP‑1 受体激动剂的制备方法及其在神经退行性疾病治疗领域的应用技术

本发明专利技术提供一种新型GLP‑1受体激动剂，具体为GLP‑1受体激动剂分子与非抗体蛋白支架基因重组而成的融合蛋白，该融合蛋白能够通过血脑屏障，在中枢神经系统发挥作用。GLP‑1受体激动剂分子与非抗体蛋白支架之间还包括连接分子。非抗体蛋白支架来自于改造后的人纤连蛋白结构域，具有血清白蛋白靶向作用，可与人血清白蛋白可逆结合。该新型GLP‑1受体激动剂在神经退行性疾病领域具有治疗作用。利用本发明专利技术提供的方法对艾塞那肽进行优化，半衰期可以达到改构前的10倍，治疗AD转基因小鼠时，每日腹腔注射一次，大大方便了治疗同时稳定了血药浓度，在脑内能够积累药物达到治疗浓度，新型GLP‑1受体激动剂为原核表达的蛋白，生产成本低，工艺简单更适合大规模生产。

Application of a new GLP 1 receptor agonist and a preparation method thereof in the field of treatment of neural degenerative diseases

The invention provides a novel GLP 1 receptor agonist, GLP receptor agonist specific 1 recombinant agent molecules and non antibody protein gene and support fusion protein. The fusion protein can pass the blood-brain barrier, play a role in the central nervous system. GLP 1 receptor molecular connection is included between agent and non antibody protein scaffolds. The non antibody protein scaffold is derived from the modified human fibronectin domain, which has the function of serum albumin and can be reversibly combined with human serum albumin. The new GLP 1 receptor agonists in neurodegenerative diseases have a therapeutic effect. The method provided by the invention optimizes natide to AI, can reach 10 times the half-life of change before treatment, AD transgenic mice, daily intraperitoneal injection time, convenient treatment and stable blood concentration, can accumulate drugs to treat concentration in the brain, the new GLP 1 receptor agonists the prokaryotic expression protein, low production cost, simple process is more suitable for mass production.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药
，尤其是涉及一种新型GLP-1受体激动剂及其在神经退行性疾病治疗领域中的应用。
技术介绍
神经退行性疾病是一类进行性发展的致残严重可致死的复杂疾病，可分为急性神经退行性病和慢性神经退行性病，前者主要包括中风(stroke)、脑损伤(brain injury)；后者主要包括阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、亨廷顿病(HD)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)等，随着时间的推移而恶化，出现功能障碍。这类疾病的脑病理改变主要有两种表现形式:一种是由细胞凋亡引起的大量神经元丢失；另一种则是神经系统没有明显细胞胞体数量减少，但神经细胞出现结构和功能的进行性、退行性变性。随着对神经退行性疾病研究的不断深入，发现越来越多的因素与神经退行性疾病发生和发展有关。其中包括：氧化应激、线粒体功能障碍、兴奋性毒素、免疫炎症、Ca2+失衡、细胞凋亡等衰老基因调控异常，脑代谢障碍等机制。目前神经系统疾病治疗的药物主要有，脑细胞活化剂、神经保护剂(钙离子拮抗剂、抗氧化药物、NMDA受体拮抗剂、抗炎药物、抗凋亡药物)、激素替代疗法，对神经退行性疾病的治疗主要是延缓病情的发展，无法逆转其病情，疗效十分有限。胰高血糖素样多肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)是近年来具有较高关注度的用于糖尿病治疗的药物，它是由肠粘膜内分泌细胞产生的一种多肽类激素，是胰高血糖素原转录后的修饰产物，由37个氨基酸组成，它有2种活性形式：GLP-1-(7-37)和GLP-1-(7-36)NH2，分子量分别为3355.7和3297.7道尔顿。GLP-1受体属于G蛋白偶联受体B家族中的胰高血糖素受体亚家族，在人和鼠的胰岛、脑以及其它脏器中都有所表达。GLP-1受体激动剂已经成为临床治疗2型糖尿病的重要手段之一。现有已经批准上市的GLP-1受体激动剂有Exenatide(艾塞纳肽)、Liraglutide(利拉鲁肽)、Lixisenatide(利西拉来)、Bydureon(艾塞那肽微球缓释制剂)、Albiglutide(阿必鲁泰)、Dulaglutide(度拉糖肽)等。近来研究表明GLP-1受体激动剂除具有控制血糖的作用以外，还具有神经保护和抗炎作用。特别地，GLP-1受体激动剂是目前已知唯一的可穿过血脑屏障(blood–brain barrier，BBB)发挥神经保护作用的神经营养因子，在神经退行性疾病治疗领域具有重大的开发潜力。例如，在AD模型动物试验中，艾塞那肽、利拉鲁肽和利西拉来在大脑中可减少Aβ斑块的形成、防止神经突触的损失和记忆损伤，减少氧化压力和炎症对大脑的损伤。在PD动物模型中，艾塞那肽在脑黑质体表现出多巴胺神经保护和在基底神经节的抗多巴胺损失。在Tau蛋白病小鼠模型中，利拉鲁肽减轻病理特异的tau磷酸化负担，减轻后肢抱紧行为的严重程度，降低与抱紧行为相关的致死率[1]。在亨廷顿病动物模型中，艾塞纳肽改善外周葡萄糖调控异常，抑制脑和胰腺中的细胞病理学进程，改善运功机能，延长亨廷顿病小鼠的存活时间，这些临床症状的改善与胰岛和脑细胞中的mhtt(突变亨廷顿)蛋白聚合物减少有关[2]。基于以上研究成果的进一步临床试验也已经展开。例如，艾塞那肽针对PD的小规模临床II期单盲试验(NCT01174810)，每日皮下注射2次，通过对45例中度PD病人的12个月的治疗和2个月的洗脱期，主要研究结果显示，药物组和对照组的MDS-UPDRS(运动障碍的社会统一帕金森病评定量表)运动评分有显著差异；次要结果显示，治疗组的认知效率比对照组有所提高，但与健康相关的生活质量两组没有差异[3]。进一步的随机、双盲、安慰剂对照的艾塞那肽针对PD的临床II期试验(NCT01971242)将在2016年结束。艾塞那肽针对AD的临床试验(NCT01255163)也已经展开，最后一次数据收集时间是2015年12月，但尚未公布结果。利拉鲁肽针对AD的一个小规模随机双盲临床II期试验(NCT01469351)已经完成，主要评价指标是PET扫描检测淀粉样蛋白沉积、脑葡萄糖代谢和WMS-IV(Wechsler Memory Scale，韦氏记忆量表)评价认知功能，结果显示治疗组内的淀粉样蛋白沉积与基线相比没有发生显著变化，治疗组和对照组间的淀粉样蛋白沉积没有显著差异，治疗组的脑葡萄糖代谢水平有所升高但不显著，两组内及两组间的总认知评分均没有发生显著变化[4]。另一项大规模的利拉鲁肽对AD(NCT01843075)的临床II期试验正在进行,旨在评价其安全性和对早期AD患者的有效性，预计最后一次主要数据的收集时间是2016年7月。根据已公开的临床前或临床阶段的研究数据,现有的GLP-1受体激动剂中的艾塞那肽,利拉鲁肽和利西拉来已经显示出对于神经退行性疾病的治疗潜力。值得注意的是，这3个GLP-1受体激动剂的分子量均小于5000Da，与人源GLP-1分子量相仿。这极有可能是它们仍然能够经由人源GLP-1转运蛋白跨越血脑屏障的重要原因。但由于这些GLP-1受体激动剂在体内的半衰期短，其能够跨越血脑屏障到达脑内的有效浓度低。这有可能是导致这些品种在临床试验中的结果较动物实验不显著的原因。而且，这些品种均需要每日注射，患者依从性差。目前，拥有更长半衰期的新型GLP-1受体激动剂已经出现，但往往采用传统的HSA(血清白蛋白)/Fc融合或者PEG偶联的长效化技术，远远超过了人源GLP-1的分子量，因此很难跨越血脑屏障，仅能用于2型糖尿病治疗，而无法在神经退行性疾病领域发挥作用。例如，阿必鲁泰是一种每周注射型的长效GLP-1受体激动剂，是2个GLP-1多肽与HSA的融合蛋白，分子量为72970道尔顿。研究表明，阿必鲁泰不能或只能很有限地透过血脑屏障[5]，因而无法在中枢神经系统内发挥治疗作用。近年来出现了一种新型的长效化技术，通过改造non-antibody protein scaffolds来使之获得对于HSA、FcRn、TfR等靶点的亲和力。将这类改造后的scaffolds与GLP-1或艾塞纳肽结合，能够获得显著延长的体内半衰期，达到药效持久的目的。例如：Amylin公司通过化学合成的方法，将[Leu14]艾塞纳肽分别与1400Da的白蛋白结合肽(ABP)和5000Da的白蛋白结合域(ABD)scaffold通过一个三肽偶联(ABP和ABD来自于Affibody AB的ABD035 scaffold)，得到的两个新分子在多个种属中对白蛋白的结合力分别为纳摩尔和皮摩尔级别，在大鼠中的单次静脉注射循环半衰期分别为11和16小时[6]。专利ZL201210186485.9在艾塞那肽肽链的末端加上人脂肪酸结合蛋白scaffold，没有对艾塞那肽的活性造成影响，从而允许以融合蛋白的形式针对特定靶点进行筛选[7]。专利201380075612.0在艾塞那肽肽链的末端加上经由人纤连蛋白结构域改造而成的血清白蛋白靶向多肽，可与血清白蛋白可逆性结合，消除半衰期为26小时[8]。特别地，这类scaffolds的分子量(仅有1万-2万道尔顿)仅是人源GLP-1分子的2-4倍。因此，我们推测可以用该类scaffolds产生的长效GLP-1受体激动剂，有效地本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新型GLP‑1受体激动剂，其特征在于：新型GLP‑1受体激动剂为GLP‑1受体激动剂分子与非抗体蛋白支架基因重组而成的融合蛋白，该融合蛋白能够通过血脑屏障，在中枢神经系统发挥作用。

【技术特征摘要】
2016.06.08 CN 20161040700021.一种新型GLP-1受体激动剂，其特征在于：新型GLP-1受体激动剂为GLP-1受体激动剂分子与非抗体蛋白支架基因重组而成的融合蛋白，该融合蛋白能够通过血脑屏障，在中枢神经系统发挥作用。2.根据权利要求1所述的新型GLP-1受体激动剂，其特征在于：所述GLP-1受体激动剂分子与非抗体蛋白支架之间还包括连接分子。3.根据权利要求2所述的新型GLP-1受体激动剂，其特征在于：所述连接分子为肽类或非肽类分子，分子量在300(Da)-5500(Da)之间。4.根据权利要求1所述的新型GLP-1受体激动剂，其特征在于：所述GLP-1受体激动剂分子为艾塞纳肽(SEQ ID:1)。5.根据权利要求1所述的新型GLP-1受体激动剂，其特征在于：所述非抗体蛋白支架来自于人纤连蛋白结构域。6.根据权利要求1所述的新型GLP-1受体激动剂，其特征在于：所述非抗体蛋白支架来自于改造后的人纤连蛋白结构域，该蛋白支架具有血清白蛋白靶向作用，可与人血清白蛋白可逆性结合。7.根据权利要求6所述的新型GLP-1受体激动剂，其特征在于：所述非抗体蛋白支架的蛋白序列为SEQ ID:2。8.根据权利要求7所述的新型GLP-1受体激动剂，其特征在于：所述GLP-1受体激动剂分子为现有GLP-1受体激动剂的多肽经过氨基酸置换或删除或插入修饰所得的变体；或(和)非抗体蛋白支架为SEQ ID:2经过氨基酸置换或删除或插入修饰所得的变体，所述插入、删除和置换的氨基酸为天然氨基酸。9.根据权利要求1或2或8所述的新型GLP-1受体激动剂，在神经退行性疾病领域具有治疗作用。10.根据权利要求9所述的新型GLP-1受体激动剂，其特征在于：所述神经退行性疾病领域为阿尔兹海默病。11.根据权利要求9所述的新型GLP-1受体激动剂，其特征在于：所述融合蛋白的分子量大于5000Da，能够穿过血脑屏障，发挥对神经退行性疾病的治疗作用。12.根据权利要求1或2或8所述的新型GLP-1受体激动剂，其特征在于：该融合蛋白可制备成药学上可接受的制剂。13.根据权利要求12所述的新型GLP-1受体激动剂，其特征在于：所述制剂还包括药学上可接受的辅料。14.根据权利要求2所述的新型GLP-1受体激动剂，其特征在于：新型GLP-1受体激动剂的连接分子为肽类时，能够在大肠杆菌胞内可溶表达，并保持生物学活性。15.根据权利要求1或4或7所述的新型GLP-1受体激动剂，其特征在于：所述新型GLP-...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢水秀，滕灵艳，史孟君，黄金，秦文远，
申请(专利权)人：上海朗安生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31