一种含小檗碱的间充质干细胞无血清培养基制造技术

本发明专利技术提供一种含小檗碱的间充质干细胞无血清培养基，包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：小檗碱5-110mg/L、碱性成纤维细胞生长因子3-20mg/ml、表皮细胞生长因子3-20mg/ml、谷胱甘肽1-10μg/mL、重组人胰岛素1-10mg/ml、人血清白蛋白5-15mg/ml、转铁蛋白1-10μg/mL、纤粘连蛋白5-15mg/L、腐胺5-30mg/L、氨基乙醇0.37-4mg/L、氢化可的松10-50μg/L和丙酮酸钠0.02-0.2mg/ml。本发明专利技术属于干细胞技术领域，本发明专利技术培养基细胞贴壁性良好，细胞增殖速率高，可以延迟MSCs进入衰亡期，延长细胞的生长周期。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于干细胞
，涉及一种含小檗碱的间充质干细胞无血清培养基。
技术介绍
间充质干细胞（mesenchymalstemcell，MSC)是属于中胚层的一类多能干细胞， 具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下不仅可分化为成骨细 胞、软骨细胞、脂肪细胞，还具有分化为肌细胞、肝细胞、造血细胞、神经细胞、胰岛细胞等多 种细胞的能力。MSC来源广泛，易于分离、培养、扩增和纯化，免疫原性低，无道德伦理问题的 限制、所以在组织工程、基因治疗和免疫治疗方面有着巨大的应用前景。 传统的含动物血清的干细胞培养基给干细胞的生产与科研带来许多不利。血清能 为干细胞提供生长增殖所需的激素、生长因子、转移蛋白和其它营养物质，但其存在诸多缺 点：批间差异较大，来源不稳定，需要大量验证工作，价格昂贵，成分不明确，不利于疫苗和 单克隆抗体等目的产品的分离纯化，容易被病毒和支原体感染等。 市场上商品化的MSCs无血清培养基如美国GIBIC0公司的STEMPRO?MSCSFM CTS?，加拿大STEMCELL公司的MesenCult?-XFMedium等基本都从国外进口，不仅价格昂 贵，培养效果不理想，与血清培养体系相比生长速度慢，而且容易出现老化特征，减弱MSCs 的分化能力。同时，这些培养基大多需要辅助产品如明胶等基质胶预先包被培养器皿，增加 了扩增细胞的工作量和传代过程污染的机会。 小檗碱，又名黄连素，是一种季铵型异喹啉生物碱，近年来研究发现其在抗菌、 抗肿瘤、降血糖、调血脂、抗氧化等方面具有良好功效。刘旭晶发表的题目为"黄连生物 碱对线粒体复合物III蛋白表达影响"的论文中指出小檗碱能提高线粒体复合物III的 表达，有效的清除自由基；张志辉等人发表的题目为"黄连碱药理活性研究进展"的文章 中指出小檗碱可作为单胺氧化酶抑制剂，而单胺氧化酶是细胞衰老的标志之一；杨玮等 人发表的题目为"小檗碱对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响"的文章中指出小檗碱在 1X10X10 5mol*L1浓度范围内能够明显促进骨髓间充质干细胞骨钙素合成和分泌， 在1X10 6~1X105mol?L1浓度范围内钙盐沉积量和钙化结节形成增加，可见，小檗碱可促 进骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化，增强骨钙化。 中国专利201210350602. 0公开了一种间充质干细胞无血清培养基，该培养基以HffiM为基础培养基，添加了L-谷氨酰胺、碳酸氢钠、Hepes和重组人胰岛素等组分，但存在 组分复杂，细胞贴壁性差的缺陷。 中国专利201110420539. 9公开了一种间充质干细胞无血清培养基，该培养基以MEM/F12为基础培养基，添加了纤连蛋白、碱性成纤维细胞生长因子和人表皮细胞生长因子 等组分，但是存在细胞生长周期短，细胞增殖效果不够理想的缺陷。 因此，现存技术中存在细胞贴壁性差，细胞生长周期短，细胞增殖效果不够理想等 缺陷。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的细胞贴壁性差，细胞生长周期短，细胞增殖效果不够理 想等缺陷，专利技术人通过大量试验筛选，得到一种含小檗碱的间充质干细胞无血清培养基，该 培养基的使用不需要预先包被培养器皿，并且细胞贴壁性良好，细胞增殖速率高，可以延迟 MSCs进入衰亡期，延长细胞的生长周期，降低了成本。 本专利技术的目的将通过下面的详细描述来进一步体现和说明。 本专利技术提供一种含小檗碱的间充质干细胞无血清培养基，包括DMEM基础培养 基，还包括如下组分及其浓度：小檗碱5-110mg/L、碱性成纤维细胞生长因子3-20mg/ml、 表皮细胞生长因子3-20mg/ml、谷胱甘肽l-lOyg/mL、重组人胰岛素l-10mg/ml、人血清白 蛋白5-15mg/ml、转铁蛋白l-lOyg/mL、纤粘连蛋白5-15mg/L、腐胺5-30mg/L、氨基乙醇 0? 37_4mg/L、氢化可的松 10-50yg/L和丙酮酸钠 0? 02-0. 2mg/ml。 上述组分及其浓度是专利技术人经大量试验筛选确定的。上述组分中，小檗碱有延 缓细胞衰老的功效，能够显著促进间充质干细胞增殖，延迟MSCs进入衰亡期，且能够保证 MSCs生物学特性保持不变，细胞表型和分泌细胞因子均正常；碱性成纤维细胞生长因子能 够刺激细胞增殖、迀移，诱导纤溶酶原激活物及胶原酶活性；表皮细胞生长因子能够促进细 胞的分裂和生长，抑制衰老基因的表达；谷胱甘肽具有抗氧化作用，有利于维持细胞生物功 能；重组人胰岛素可提高合成代谢能力，刺激细胞生长并调节葡萄糖的摄取量；人血清白 蛋白能提供细胞生长所需的营养物质，还可调节渗透压，保护细胞免受机械损伤；转铁蛋白 是血浆中主要的含铁蛋白质，为细胞内化和细胞代谢提供所需的铁；纤粘连蛋白是细胞外 基质的粘着糖蛋白，能够使细胞和细胞外基质互相粘连，使细胞的贴壁效果更好；腐胺的含 量水平高低与细胞的PH值相关，通过控制腐胺的含量能够调节细胞的PH值；氨基乙醇能够 有效清除自由基，提高抗氧化能力；氢化可的松作为一种糖皮质激素，能够防止或抑制细胞 中介的免疫反应；丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源。 优选地，本专利技术提供的一种含小檗碱的间充质干细胞无血清培养基，包括DMEM 基础培养基，还包括如下组分及其浓度：小檗碱20-70mg/L、碱性成纤维细胞生长因子 5-15mg/ml、表皮细胞生长因子5-15mg/ml、谷胱甘肽2-10yg/mL、重组人胰岛素l-6mg/ml、 人血清白蛋白7-13mg/ml、转铁蛋白1-6yg/mL、纤粘连蛋白8-12mg/L、腐胺5-20mg/L、氨基 乙醇0? 8_2mg/L、氢化可的松10-30yg/L和丙酮酸钠0? 05-0.lmg/ml。 优选地，本专利技术提供的一种含小檗碱的间充质干细胞无血清培养基，包括DMEM 基础培养基，还包括如下组分及其浓度：小檗碱40mg/L、碱性成纤维细胞生长因子10mg/ ml、表皮细胞生长因子12mg/ml、谷胱甘肽10yg/mL、重组人胰岛素2mg/ml、人血清白蛋白 10mg/ml、转铁蛋白6yg/mL、纤粘连蛋白10mg/L、腐胺5mg/L、氨基乙醇lmg/L、氢化可的松 30yg/L和丙酮酸钠 0? 07mg/ml。 优选地，所述DMEM基础培养基为低糖型DMEM基础培养基。 优选地，所述的间充质干细胞从骨髓、脂肪、肌肉、脐带、胎盘、羊水或脐血中分离 获得。 优选地，本专利技术提供的一种含小檗碱的间充质干细胞无血清培养基，还包括碳酸 氢钠，碳酸氢钠的浓度为3. 7g/L。 优选地，所述谷胱甘肽为还原型谷胱甘肽。 相应地，本专利技术还提供含小檗碱的间充质干细胞无血清培养基的制备方法，包括 如下步骤：向DMEM基础培养基中，按所述浓度加入小檗碱、碱性成纤维细胞生长因子、表皮 细胞生长因子、谷胱甘肽、重组人胰岛素、人血清白蛋白、转铁蛋白、纤粘连蛋白、腐胺、氨基 乙醇、氢化可的松和丙酮酸钠，混匀，过膜除菌即得。 此外，本专利技术还提供含小檗碱的间充质干细胞无血清培养基在间充质干细胞无血 清培养中的用途。 与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种含小檗碱的间充质干 细胞无血清培养基，与传统的含血清培养基相比，本专利技术提供的培养基不含动物来源血清， 批次间稳定无干扰本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含小檗碱的间充质干细胞无血清培养基，其特征在于：包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：小檗碱5‑110mg/L、碱性成纤维细胞生长因子3‑20mg/ml、表皮细胞生长因子3‑20mg/ml、谷胱甘肽1‑10μg/mL、重组人胰岛素1‑10mg/ml、人血清白蛋白5‑15mg/ml、转铁蛋白1‑10μg/mL、纤粘连蛋白5‑15mg/L、腐胺5‑30mg/L、氨基乙醇0.37‑4mg/L、氢化可的松10‑50μg/L和丙酮酸钠0.02‑0.2mg/ml。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王一飞，梁峰，王巧利，
申请(专利权)人：广州暨南生物医药研究开发基地有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44