本发明专利技术涉及分子生物学领域，具体地说是一种贝类snRNA?U6基因的全序列及其引物应用于贝类microRNA的表达分析。本发明专利技术公开了一种基于荧光定量PCR的miRNA相对定量法表达分析中的内参基因及引物。我们克隆获得了长牡蛎U6基因全序列，它的同源基因human?snRNAU6表达恒定，可用于miRNA的表达分析内参。并且以它为内参做出的表达结果与miRNA测序表达谱高度吻合。从而旁证了该U6基因适合作为miRNA表达分析的内参。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及分子生物学领域，具体地说是一种贝类snRNA?U6基因的全序列及其引物应用于贝类microRNA的表达分析。本专利技术公开了一种基于荧光定量PCR的miRNA相对定量法表达分析中的内参基因及引物。我们克隆获得了长牡蛎U6基因全序列，它的同源基因human?snRNAU6表达恒定，可用于miRNA的表达分析内参。并且以它为内参做出的表达结果与miRNA测序表达谱高度吻合。从而旁证了该U6基因适合作为miRNA表达分析的内参。【专利说明】—种贝类snRNA U6基因及其引物和应用
本专利技术涉及分子生物学领域，具体地说是一种贝类snRNA U6基因的全序列及其引物应用于贝类microRNA的表达分析。
技术介绍
贝类，属软体动物门中的瓣鳃纲(或双壳纲)，常见的种类有牡蛎、贻贝、蛤、蛏等。现存种类I万种左右，其中80%生活于海洋中。贝类中绝大多数种均可食用，很多贝类的肉质肥嫩，鲜美可口，营养丰富，具有很高的经济价值，是世界上重要的水产养殖对象。MicroRNA (miRNA)是一类在生物界中广泛存在的小分子非编码单链RNA，长约21~24nt，它能通过降解或抑制互补的靶mRNA来进行转录后基因表达调控，并且在生物的各个发育时期和不同的组织器官中广泛表达，参与到生物的各种生理活动中，因其在生物中的重要性,近几年国内外科学家对miRNA的研究倍加重视。对贝类microRNA的研究有助于推动贝类养殖业的发展。贝类中只报导了 65条microRNA (miRBase 18)，且暂时没有可用于microRNA定量的内参基因报导。目前对miRNA的表达分析主要有大规模测序，基因芯片和实时荧光定量法。大规模测序和基因芯片法为高通量方法，成本很高，不适于少量miRNA的功能分析。而基于SYBRGreen染料荧光定量PCR的miRNA相对定量法，参见文献:【Shi R, Chiang VL (2005) Facilemeans for quantifying microRNA expression by real-time PCR.Biotechniques 255039:519-525.】表达分析有着操作相对简单，成本较低，灵敏度高的优势，广受研究人员的欢迎。而在相对定量中，内参的选择尤为重要。目前内参的选 择大多数采用一些表达相对恒定的管家基因，如U6，5S rRNA等。U6基因是一种核剪切子RNA，参与到pre-mRNA的加工剪切，它的序列比较保守，在不同的物种中同源性高，参见文献【Brow DA, Guthrie C (1988) Spliceosomal Rna U6 Is RemarkablyConserved from Yeast to Mammals.Nature 334:213-218.】。但是目前在贝类中的 U6 基因序列尚未被克隆，也没有基于贝类U6基因设计的引物。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种贝类microRNA定量的内参基因及其引物。即为基于荧光定量PCR的miRNA相对定量法表达分析中的内参基因及引物。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为:一种贝类small nuclear RNA U6基因，具有序列表SEQID No:l中喊基序列。根据权利要求所述基因设计的一对内参引物，其特征在于:用于基于荧光定量PCR的miRNA相对定量法中，其以polyA加尾反转的cDNA为模板的内参引物:Sense primer: 5’ -CGGCAGTACATATATTAAAATTGGAACGA-3’Ant1-sense primer: 5’ -TGGAACGCTTCACGAATTTGCGTGTCATC-3’。所述基因或引物作为内参基因在相对定量法实时荧光定量PCR中的应用。所述基因或引物作为相对定量中的内参基因在实时荧光定量PCR的贝类microRNA表达分析中的应用，它们的作用在于校正上样量，上样过程中的实验误差，保证实验的准确性。具体步骤为: a.候选miRNA序列的获得:从已有数据库或其它来源获得欲做表达分析的miRNA序列。b.引物设计:根据获得的候选miRNA序列设计该miRNA相应的特异引物(扩增产物单一，具体为溶解曲线峰单一，3%的琼脂糖胶检测条带单一)。c.PCR模板的准备:在收集的样品中用E.Z.N.A.? miRNA kit(试剂盒，市购于 OMEGA 公司)提取 <200nt 的 small RNA 后，用 One Step PrimeScriptf miRNA cDNAsynthesis Kit (试剂盒,市购于TaKaRa公司)按照说明书加polyA尾后反转成cDNA。d.突光定量PCR反应:用miRNA相应的特异引物和universal reverseprimer (由上述TaKaRa试剂盒提供)以U6基因为内参在ABI 7500FASTreal_time PCR仪中进行。e.获得各模板中的相对表达量:结果采用2_ΔΔα法计算，ΔΔ Ct = (Ctniim-Ctu6)sample2_ (CtmiRNA_Ctu6) sampiel。f.根据表达情况进行后续的功能分析。本专利技术具有如下优点:1.本专利技术能够适用于少量miRNA的表达分析，操作相对简单，成本较低，灵敏度闻。2.本研究中，我们克隆获得了 U6基因全序列(见实施例1)，它的同源基因humansnRNA u6表达恒定，可用于miRNA的表达分析内参(见实施例4)。并且以它为内参做出的表达结果与miRNA测序表达谱高度吻合(见实施例3)。从而旁证了 U6基因适合作为miRNA表达分析的内参。3.本专利技术提供的U6基因序列保守，与线虫、果蝇、小鼠、人的U6基因同源比对，结果显示该基因在不同的物种中高度保守，同源性可达到83.486% (图1)。【专利附图】【附图说明】:图1.长牡蛎U6基因与线虫、果蝇、小鼠、人的U6基因同源比对，结果显示该基因在不同的物种中高度保守，只有5’端有一些变异。图2.U6内参引物扩增产物的溶解曲线图。图3.PCR产物用3 %的琼脂糖胶确定无非特异扩增。图4.Ct值与Log (起始模板拷贝数)关系图。图5.长牡蛎的 4 个 miRNA 基因(m0203_5p，m0250_3p, m0252_3p, m0420_5p)的相对定量结果(实线)与测序表达谱结果(虚线)的比较。Bla:囊胚期幼虫；Umb:壳顶期幼虫；s:腮组织。【具体实施方式】下面的实施例中将对本专利技术作进一步的阐述，但本专利技术不限于此。本专利技术所采用实验用品均来自市购，所用英文标记均为产品包装名称。实施例1根据同源序列搜索从长牡蛎基因组中获得推测的牡蛎U6基因序列。在其保守区域设计引物，获得U6基因的部分序列，根据获得的部分序列，利用RACE技术获得U6基因全长。序列表(I) SEQ ID NO I的信息序列特征长度:109nt类型:核酸链型:双链拓扑结构:线形分子类型:DNA特性名称:snRNA(1 — 109)来源:长牡蛎序列描述:GTACTTGCTTTTCGGCAGTACATATATTAAAATTGGAACGATACAGAGAAGATTAGCATGGCCCCTGCGCAAGGATGACACGCAAATTC本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种贝类small?nuclear?RNA?U6基因，其特征在于：具有序列表SEQID?No:1中碱基序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄雯，阙华勇，许飞，李莉，张国范，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：
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