本发明专利技术涉及一种用于制备抗猪瘟病毒转基因乳酸菌制剂的重组表达载体。该重组表达载体命名为pYG-Tα1-E2，如序列表SeqNo.1所示。本发明专利技术还涉及一种抗猪瘟病毒转基因乳酸菌制剂，依据猪瘟病毒主要经肠道黏膜感染途径入侵机体，继而引发动物疾病，增强机体特异性黏膜免疫，是阻止病原入侵的首要防线，利用乳酸菌作为介导黏膜免疫传递疫苗抗原的安全级活菌载体，以猪瘟病毒主要免疫保护性抗原E2蛋白作为免疫原，胸腺肽为免疫增强剂，构建了具有抗猪瘟病毒功能的转基因乳酸菌制剂。相比于传统猪瘟疫苗生产具有安全性好、生产成本低、产量高、易于操作的优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于制备抗猪瘟病毒转基因乳酸菌制剂的重组表达载体。
技术介绍
猪痕(Classical swine fever, CSF)是由猪痕病毒(Classical swine fevervirus, CSFV)引起猪的一种以急性出血和发热为主要特征的烈性传染病，是危害养猪业发展的主要传染病之一。自然条件下，猪是唯一易感动物，死亡率高，给养猪业造成了巨大的经济损失。目前CSF的主要流行区有:(1)东南亚疫区，由于控制措施不力，疫情仍然较重；(2)中南美洲疫情稳定区，疫病流行逐年减少；(3)欧洲特别是西欧属疫情活跃区，虽然采取了严密的控制措施，仍经常爆发，是近年来CSF流行的中心。在我国，CSF流行呈现典型和非典型共存、持续感染和隐性感染共存、免疫耐受和带毒综合征共存等，疫苗接种仍是防控CSF的主要措施。一些发达国家，如美国、加拿大及一些欧盟成员国等采取严格防疫措施和剔除CSF感染猪净化猪群的方法控制和消灭CSF，成果虽显著，但经济损失较大。早期的CSF灭活疫苗因免疫期短、产生免疫保护力慢、生产成本高且繁殖CSF强毒潜在散毒危险等缺陷，自1982年起我国已停止该类疫苗的生产。CSF弱毒疫苗能够对CSF强毒的攻击提供保护，在CSF流行的地区，仍是控制该病的重要措施之一。尽管CSF弱毒疫苗能产生有效保护，但在长期免疫接种的胁迫下CSFV可能出现抗原变异，同时CSF细胞弱毒疫苗难以剔除牛病毒性腹泻病毒的污染，还可能与野毒重组或自然突变而造成毒力返强，并可通过胎盘感染造成胎儿死亡，先天性感染仔猪出现免疫耐受现象。此外，由于CSF弱毒疫苗干扰CSF的血清诊断，难以区分CSF野毒感染猪与免疫猪，同时疫苗保存和使用不当以及疫苗免疫不能覆盖所有易感猪群，均会导致免疫失败，而且弱毒苗在接种后至少15d内能够在淋巴器官(主要是扁桃体)内一定程度的复制，这期间利用标准的诊断方法难以将其与野毒区分开来，不利于鉴别诊断，欧盟已禁止使用CSF弱毒疫苗，而是采用扑杀感染猪和CSF血清阳性猪的措施以控制和消灭CSF。然而采用扑杀政策所需人力、物力和资金巨大，发展中国家更是难以承受，这促使人们研究和开发新型CSF疫苗来防控该病。目前利用反向遗传学技术改造缺失E2或Erns基因的突变病毒株成为可能，这种缺失突变株只能在反式提供缺失蛋白的感受态细胞系上生长，将其作为疫苗安全性好，但此类疫苗一个值得关注的焦点是突变疫苗株与野毒株之间存在发生重组的可能性。在重组病毒疫苗的研制中，利用CSFV-E2糖蛋白能够诱导机体产生中和抗体的特性，构建了重组痘苗病毒、腺病毒和伪狂犬病毒等，在临床上都能够诱导有效的免疫保护，但所用病毒载体存在生物安全隐患。为了克服CSF弱毒疫苗的固有缺陷，又研发了 CSF亚单位标记疫苗，其中最有效的CSF亚单位疫苗也是基于CSFV-E2糖蛋白研制，疫苗免疫动物后仅产生抗E2蛋白抗体，而野毒感染的猪却同时能够产生抗Erns蛋白的抗体，利用现有的ELISA抗体检测方法能够加以区分，弥补了经典弱毒疫苗的不足，但是其保护效率还有待于进一步的评估。猪瘟疫苗的设计是多样的，使我们难以确认哪一种是最好的选择。在不同的研究中，疫苗剂量、免疫次数、免疫途径、免疫攻毒之间的时间间隔均不相同，攻毒用的毒株、病毒毒力、攻毒剂量与途径以及用来评估疫苗效果的标准也不相同。结合猪瘟病毒主要经消化道黏膜系统侵入机体引起动物发病的特点，研制能有效地刺激黏膜免疫系统产生局部免疫应答继而诱导系统免疫应答的黏膜免疫疫苗，对疫病防治具有重要意义。理想的黏膜疫苗可以促进抗原和免疫系统之间的有效接触，诱导体液和细胞免疫反应，产生长期的免疫保护作用，且稳定、无毒性。针对基因工程减毒病毒和细菌的应用而带来的环境和安全问题，发展了以乳酸菌为代表的非致病性活菌载体。乳酸菌作为外源基因表达宿主菌，其优越性主要表现在:①乳酸菌能在呼吸系统、消化系统、泌尿系统定植，对维持微生态平衡具有重要作用不具有致病性，是公认的安全级微生物，易构建成食品级基因克隆及表达系统，有效提高基因工程产品的安全性;③同肠胃外免疫途径相比，经黏膜免疫，可以诱发IgA产生4免疫方法简单、安全；⑥具有免疫佐剂作用、固有免疫原性及抗胆汁酸能力。因此，乳酸菌作为免疫接种的口服疫苗载体极具开发潜力。乳酸菌在诱导黏膜免疫应答时或经过小肠上皮的微皱裙细胞(microfold cell, M细胞)，或者通过树突状细胞(dendritic cell, DC)进入固有层，激活Th2淋巴细胞，产生白介素IL-5，激活B细胞，分泌IgA，形成黏膜表面抗体slgA，同时可提高免疫活性因子如IL-2、IFN-α的分泌，阻止致病微生物的吸附和入侵，而且可将特异性抗原分子携带并分泌到肠道，穿过肠壁进入黏膜下层，引起细胞免疫和体液免疫。 因此，本专利技术依据CSFV主要经黏膜感染为出发点，以阻止病原感染的第一道防线为指导思想，利用乳酸菌作为传递抗原的载体进行抗CSF基因工程乳酸菌免疫制剂的制备。本专利技术以猪瘟病毒主要免疫保护性抗原E2蛋白作为免疫原，胸腺肽为免疫增强剂，构建了具有抗猪瘟病毒功能的转基因乳酸菌制剂。实验证实，本专利技术一种抗猪瘟病毒转基因乳酸菌制剂能有效地刺激黏膜免疫系统产生局部免疫应答，进而引起全身性系统免疫反应，可作为预防猪瘟的口服疫苗。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有抗猪瘟病毒感染的转基因乳酸菌制剂的制备方法。本专利技术根据猪瘟病毒主要经肠道黏膜感染入侵机体的特点，利用常用乳酸菌一保加利亚乳杆菌{Lactobacillus bulgaricus)作为介导黏膜免疫传递疫苗抗原的安全级活菌载体，以胸腺肽T α I作为免疫增强剂，猪瘟病毒主要免疫保护性抗原E2蛋白作为免疫原，研发了具有抗猪瘟病毒感染的转基因乳酸菌制剂，通过口服免疫，可达到预防猪瘟的目的。本专利技术的目的通过下述技术方案实现: 一种用于制备抗猪瘟病毒转基因乳酸菌的重组表达载体pYG-Τ α 1-Ε2，如序列表SeqN0.1所示。本专利技术还具有如下特征:1、一种抗猪瘟病毒转基因乳酸菌制剂，其特征在于，将以胸腺肽Tα I作为免疫增强齐U，猪瘟病毒主要免疫保护性抗原Ε2蛋白作为免疫原，构成的重组表达载体pYG-Τα 1-Ε2电转化入乳酸菌中。本专利技术还具有如下技术特征: 2、一种抗猪瘟病毒转基因乳酸菌制剂的制备方法，用于胸腺肽TaI基因PCR扩增引物对， 上引物T-F:如序列表Seq N0.2所示， 下引物T-R:如序列表Seq N0.3所示。3、一种抗猪瘟病毒转基因乳酸菌制剂的制备方法，用于猪瘟病毒E2蛋白基因PCR扩增引物对， 上引物E-F:如序列表Seq N0.4所示， 下引物E-R:如序列表Seq N0.5所示。4、一种抗猪瘟病毒转基因乳酸菌制剂的制备方法，包括如下步骤: (I)参照Genbank中发布的胸腺肽(Τ α I)基因序列设计PCR引物对，上引物T-F:如序列表Seq N0.2所示；下引物T-R:如序列表Seq N0.3所示。(2)根据猪瘟病毒Ε2蛋白基因设计PCR扩增引物对，上引物E-F:如序列表SeqN0.4所示,下引物E-R:如序列表Seq N0.5所示。(3)进行常规链式聚合酶反应分别扩增T α 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于制备抗猪瘟病毒转基因乳酸菌的重组表达载体pYG?Tα1?E2，其特征在于，如序列表Seq?No.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种用于制备抗猪瘟病毒转基因乳酸菌的重组表达载体pYG-Τα 1-E2，其特征在于，如序列表Seq N0.1所示。2.一种抗猪瘟病毒转基因乳酸菌制剂，其特征在于，将以胸腺肽Ta I作为免疫增强齐U，猪瘟病毒主要免疫保护性抗原E2蛋白作为免疫原，构成的重组表达载体pYG-Ta 1-E2电转化入乳酸菌中。3.根据权利要求2所述的一种抗猪瘟病毒转基因乳酸菌制剂的制备方法，用于胸腺肽Tal基因PCR扩增引物对，其特征在于， 上引物T-F:如序列表Seq N0.2所示， 下引物T-R:如序列表Seq N0.3所示。4.根据权利要求2所述的一种抗猪瘟病毒转基因乳酸菌制剂的制备方法，用于猪瘟病毒E2蛋白基因PCR扩增引物对，其特征在于， 上引物E-F:如序列表Seq N0.4所示， 下引物E-R:如序列表Seq N0.5所示。5.根据权利要求2所述的一种抗猪瘟病毒转基因乳酸菌制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)、参照Genbank中发布的胸腺肽(Τα I)基因序列设计PCR引物对，上引物T-F:如序列表Seq N0.2所示；下引物T-R:如序列表Seq N0.3所示； (2)、根据猪瘟病毒Ε2蛋白基因设计PCR扩增引物对，上引物E-F:如序列表Seq N0.4所示，下引物E-R:如序列表Seq N0.5所示； (3)、进行常规链式聚合酶反应分别扩增Tα I基因及Ε2基因； (4)、构建重组表达载体PYG-Tα 1- Ε2 ； (5)、构建转基因乳酸菌。6.根据权利要求2所述的一种抗猪瘟病毒转基因乳酸菌制剂，其特征在于，用于预防猪瘟的口服疫苗。7.根据权利要求5所述的一种抗猪瘟病毒转基因乳酸菌制剂的制备方法，其特征在于:所述步骤(3)采用常规链式聚合酶反应扩增Ta I基因的具体步骤如下:将混合液在70°C加热5min，25°C退火5min，37°C延伸30m...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐义刚，李丹丹，刘忠梅，吴岩，李苏龙，刘新亮，
申请(专利权)人：黑龙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：
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