双歧杆菌功能基因无痕敲除方法的建立技术

一种双歧杆菌功能基因无痕敲除方法的建立，该建立方法包括构建serpin基因自杀型打靶载体UPD；以pDG7为骨架，装载上双歧杆菌的启动子，构建双歧杆菌-大肠杆菌的穿梭表达载体pDG-Hup；在pDG-Hup基础上构建Cre酶基因的双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体pDG-hup-cre；将打靶载体转化入双歧杆菌，通过同源重组得到双歧杆菌serpin基因缺失株；利用位点特异性重组酶体系Cre-loxp系统，将双歧杆菌基因组中引入的壮观霉素spc基因移除，实现了双歧杆菌抗性基因的无痕敲除。本发明专利技术利用同源重组的原理获得双歧杆菌功能基因的缺失株，可应用于双歧杆菌功能基因的敲除，改良菌种。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于双歧杆菌基因工程中的应用，具体是涉及一种双歧杆菌功能基因无痕敲除方法。
技术介绍
基因敲除是利用DNA同源重组原理进行的一种修饰内源基因的方式，使外源DNA与受体细胞基因组DNA上的靶基因同源序列之间发生重组，将外源载体DNA定点整合入靶基因的预定位点上，或与靶基因某一 DNA片段置换，完成对基因组DNA靶基因的精确修饰和改造，造成靶基因的结构或组成的突变，导致基因功能丧失，且经修饰和改造的基因能够随基因组DNA的复制而稳定的复制。它具有定位性强、靶基因敲除后能随基因组DNA稳定遗传的特点，克服了诱变的随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造微生物遗传物质的方法。在工业微生物菌种改良中，通过靶基因的敲除改变微生物的代谢途径和代谢流，不仅能提高发酵产品的产量和产生新的代谢产物，还能改善发酵工业发酵途径和过程的人工调控性，是21世纪最有前景的微生物菌种改良手段。Cre-loxp体系在基因打靶技术中的应用可以说给基因靶位技术带来了一场革命。Cre重组酶是来源于pi噬菌体的重组酶家族的分子量38kd的一种活性蛋白。它不仅具有催化活性，而且跟限制酶相似，识别特异的DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双歧杆菌功能基因无痕缺失株的建立方法，其特征是，包括以下步骤：(1)???将SEQ?ID.NO.1通过EcoR?V位点和Pst?I酶切连接到pUC57载体上，得到pUC57?LoxP载体；(2)???以pER8质粒为模板，通过引物SEQ.?ID.NO.2和SEQ.?ID.NO.3扩增壮观霉素抗性基因spc，将扩增产物经过Xho?I和Apa?I双切后与pUC57?LoxP载体连接，构建得到载体pUC?Spc；(3)???以双歧杆菌的基因组作为模板，通过引物SEQ.?ID.NO.4和SEQ.?ID.NO.5扩增，将扩增产物经过EcoR?I和?Spe?I双切后与pUC?Spc载体连接，构建得到载...

【技术特征摘要】
1.一种双歧杆菌功能基因无痕缺失株的建立方法，其特征是，包括以下步骤: (1)将SEQ ID.N0.1通过EcoR V位点和Pst I酶切连接到pUC57载体上，得到pUC57-LoxP 载体； (2)以pER8质粒为模板，通过引物SEQ.1D.N0.2和SEQ.1D.N0.3扩增壮观霉素抗性基因spc，将扩增产物经过Xho I和Apa I双切后与pUC57-LoXP载体连接，构建得到载体pUC-Spc ； (3)以双歧杆菌的基因组作为模板，通过引物SEQ.1D.N0.4和SEQ.1D.N0.5扩增，将扩增产物经过EcoR I和Spe I双切后与pUC-Spc载体连接，构建得到载体pUC-spc-serpinup800 ；(4)以双歧杆菌的基因组作为模板，通过引物SEQ.1D.N0.6和SEQ.1D.N0.7扩增，将扩增产物经过Bgl II和Hind III双切后与pUC-SpC-Serpinup8(l(l载体连接，构建得到打靶载体质粒 pUC-spc-serpinup+d_,即 UPD ； (5)SEQ.1D.N0.8序列经EcoR I和Sal I双酶切连接至pDG7，构建穿梭表达载体pDG-Hup ； (6)以含有Cre酶基因的pCr印A质粒为模板，通过引物SEQ.1D.N0.9和SEQ.1D.N0.10扩增Cre酶基因；扩增产物经过Xho I和Sal I双切后，与pDG_Hup连接，构建得到 pDG-Hup-Cre ； (7)打祀载体的转化:将打祀载体质粒pUC-spc-serpinup+d_加入到双...

【专利技术属性】
技术研发人员：万翠香，魏华，夏慧玲，许恒毅，章昭琳，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：