通过糖多孢红霉菌SACE_7301基因途径提高红霉素产量制造技术

本发明专利技术公开了一种通过糖多孢红霉菌SACE_7301基因途径提高红霉素产量，其特征在于所述的方法为：通过基因工程途径使糖多孢红霉菌SACE_7301基因拷贝数增加或提高SACE_7301基因表达量，获得糖多孢红霉菌红霉素高产工程菌株，用所述技术获得的菌株发酵可以提高红霉素产量。

Improvement of erythromycin production by the SACE_7301 gene pathway of polysaccharide

The invention discloses a method for increasing the production of erythromycin by sac.erythraea SACE_7301 pathway, which is characterized in that the method is: the copy number increase or increase the SACE_7301 expression of SACE_7301 gene in Saccharopolyspora erythraea by means of genetic engineering, obtain sac.erythraea engineering high erythromycin producing strains, strains fermentation the technology can improve the production of erythromycin.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术主要涉及一种提高发酵生产红霉素产量的方法，尤其涉及一种通过增加糖多孢红霉菌染色体上正向调控基因SACE_7301提高红霉素产量的方法。
技术介绍
放线菌次级代谢产物具有广泛的用途，如抗生素、抗癌剂、免疫调节剂、驱虫剂、昆虫防治剂。目前发现的23000种生物活性次级代谢产物中，有10000多种是放线菌产生的。然而，这些次级代谢物原始产量非常低，需要通过筛选才能获得工业生产高产菌株。过去工业生产菌株主要通过随机物理或化学诱变方法获得。传统的随机诱变技术不但耗时，而且无法指导对育种进行理性设计。本专利技术目的就是通过基因工程途径定向改变基因来获得红霉素高产菌株，用于红霉素或中间产物生产。糖多孢红霉菌是1952年从土壤中分离出的革兰氏阳性丝状放线菌，其次级代谢产物红霉素A是重要的广谱大环内酯类抗生素，目前红霉素系列化学衍生物(克拉霉素、阿奇霉素、罗红霉素、泰利霉素等)被广泛用来治疗感染性疾病。由于红霉素及其衍生物每年的世界销售量达数百亿美元，吸引了许多科学家来研究如何提高其产量。2007年，Oliynyk等报道了糖多孢红霉菌NRRL23338的基因组序列，但糖多孢红霉菌调控基因研究很少，到目前为止只有bldD(SACE_2077)和SACE_7040的调控基因研究报道，及我们申报的专利技术专利(申请号 201210099708.8)。原核生物的转录调控子可以分为LysR、AraC/XylS、TetR、LuxR、Lac1、ArsR、IcIR、MerR、AsnC、MarR> NtrC (EBP)、OmpR> DeoR、Cold shock、GntR 和 Crp 等 16 个家族，其中TetR家族成员在DNA结合域方面具有螺旋_转角-螺旋(HTH)的结构特征。TetR家族在细菌中普遍存在，大约有2000多个成员，但到目前为止人们只发现100多个成员的特征。糖多孢红霉菌染色体上有 101个TetR家族基因，其中有些基因可能参与红霉素生物合成。
技术实现思路
本专利技术目的就是通过增加糖多孢红霉菌中正向调控基因SACE_7301拷贝，提高红霉素产量。本专利技术是通过以下技术方案实现的:—种构建红霉素高产菌株的技术方法，所述的方法为:通过基因工程途径使糖多孢红霉菌SACE_7301基因拷贝数增加或提高SACE_7301基因表达量，获得糖多孢红霉菌红霉素高产工程菌株，用所述的菌株发酵生产红霉素。以SACE_7301为出发点构建红霉素高产菌株的技术方法，其特征在于以糖多孢红霉菌SACE_7301基因或其表达产物为出发点，寻找到与红霉素生物合成相关的新基因或蛋白，通过对寻找到的所有相关基因进行失活、增加拷贝、提高表达量等办法构建糖多孢红霉菌红霉素高产菌株，用于发酵生产红霉素或中间产物。本专利技术的优点是:本专利技术研究中筛选到了红霉素生物合成正向调控子SACE_7301，通过基因工程途径增加糖多孢红霉菌染色体上SACE_7301基因拷贝，能够获得红霉素高产菌株，为工业生产提高红霉素发酵产量提供技术支持。糖多孢红霉菌A226中敲除SACE_7301基因时红霉素产量降低了 34.5%，而在ASACE_7301基因突变株中回补SACE_7301基因，红霉素产量部分恢复，表明SACE_7301是一个参与红霉素生物合成的正向调控子。当在糖多孢红霉菌A226中增加SACE_7301基因拷贝时，红霉素产量较出发菌株提高9.5%，说明在糖多孢红霉菌中提高SACE_7301基因拷贝，可以构建红霉素高产菌株。同时，红霉素生物合成基因调控是一个网络，通过基因工程途径改变SACE_7301基因或产物的上下游调控因子，也可构建红霉素高产菌株，用于提高发酵红霉素产量。附图说明图1为染色体同源重组技术示意图硫链丝菌肽抗性基因(tsr)替换了糖多孢红霉菌A226染色体上SACE_7301基因；图2为SACE_7301基 因在糖多孢红霉菌染色体上的位置及编码氨基酸序列参见 NCBI (http:1Iwm.ncb1.nlm.nih.gov/gene term=SACE 7301 及 http: //www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/134096620 report=genbank&from=8107531&to=8108388)；图3为Λ SACE_7301突变体鉴定及红霉素产量分析(A) ASACE_7301 突变体鉴定:SACE_7301 基因(660bp)被 tsr 抗性基因(1360bp)替换后长度增加了 700bp ；M, 5000bp DNA Marker(B)糖多孢红霉菌出发菌株A226、突变菌株ASACE_7301及回复菌株Δ SACE_7301/pZMW7301 (对照为 Λ SACE_7301/pZMW)在 TSB 培养基中 30°C发酵 6 天产物HPLC分析；图4为SACE_7301基因过表达及红霉素产量分析(A)A226/ pZMW7301过表达菌株PCR鉴定:PCR产物为pZMW载体上apr抗性基因(776bp) ；M, 5000bp DNA Marker(B)糖多孢红霉菌出发菌株A226、SACE_7301过表达菌株A226/ pZMW7301 (对照为A226/pZMW)在TSB培养基中30°C发酵6天产物HPLC分析。具体实施例方式实施例11.1菌株、质粒与生长条件试验中使用到的菌株和质粒见表I。大肠杆菌在37° C的液体LB (Luria-Bertani)培养基或在添加1.25%琼脂的LB平板上培养。红霉素生产菌糖多孢红霉菌A226及其工程菌株在30° C胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基或在含有2.2%琼脂的R3M平板上培养。1.2材料、DNA操作与测序PEG3350、溶菌酶、TES、酪蛋氨基酸、硫链丝菌肽、安普霉素从Sigma公司购买。TSB、酵母提取物、蛋白胨购买于Oxoid公司。甘氨酸、琼脂粉、氯化钠和其它生物学试剂都购于试剂公司。大肠杆菌和糖多孢红霉菌的一般操作技术按照标准操作。引物的合成和DNA测序由上海捷瑞生物工程有限公司完成。表I试验中使用到的菌株和质粒权利要求1.SACE_7301基因的新功能:SACE_7301基因产物可以正向调控红霉素生物合成。2.—种构建红霉素高产菌株的技术方法，其特征在于所述的方法为:通过基因工程途径使糖多孢红霉菌SACE_7301基因拷贝数增加或提高SACE_7301基因表达量，获得糖多孢红霉菌红霉素高产工程菌株，用所述的菌株发酵生产红霉素。3.根据权利要求1所述的SACE_7301基因的新功能，其特征在于以糖多孢红霉菌SACE_7301基因或其表达产物为出发点，寻找到与红霉素生物合成相关的新基因或蛋白，通过对寻找到的所有相关基因进行失活、增加拷贝、提高表达量等办法构建糖多孢红霉菌红霉素高产菌株，用于发酵生产红霉素或中间产物。全文摘要本专利技术公开了一种通过糖多孢红霉菌SACE_7301基因途径提高红霉素产量，其特征在于所述的方法为通过基因工程途径使糖多孢红霉菌SACE_7301基因拷贝数增加或提高SACE_7301基因表达量，获得糖多孢红霉菌红霉素高产工程菌株，用所述技术获得的菌株发酵可以提高红霉素产量。文档编号C12N1/21GK10320本文档来自技高网...

【技术保护点】
SACE_7301基因的新功能：SACE_7301基因产物可以正向调控红霉素生物合成。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张部昌，刘敬涛，吴杭，袁莉，
申请(专利权)人：安徽大学，
类型：发明
国别省市：