本发明专利技术抗人LOC339524蛋白的单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其用途涉及生物医药领域，其特征在于：通过设计独特的免疫原免疫动物获得了抗人LOC339524蛋白的单克隆抗体及杂交瘤细胞株，实验数据证明，获得的单克隆抗体具有优异的特异性，适合于研究LOC339524蛋白的分布、功能和作用机制。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药工程技术，特别是涉及抗人L0C339524蛋白的单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其用途。
技术介绍
人L0C339524(Genbank)基因位于染色体1ρ22.3位点上，由39，440个碱基组成。L0C339524蛋白心、脑、肺、肝等重要脏器都有表达，而且主要在细胞核内表达，部分组织细胞浆内也有表达，并能释放到血清中。L0C339524蛋白的功能尚不清楚。免疫检测技术是基于抗原一抗体反应的原理对待测物(抗原/抗体)进行定量定性分析的检测方法，具有特异性强、灵敏度高、便捷等优点，是现代生命科学的重要研究手段，在生物分析检测领域有着广泛的应用前景。构建基于免疫检测技术的L0C339524蛋白检测体系对于深入研究L0C339524蛋白的分布、功能和作用机制等都具有重要的意义，同时具有巨大的社会和经济价值。目前国内外均未发现有关于L0C339524蛋白的抗体。因此，制备高特异性的L0C339524单克隆抗体成为迫切需要。
技术实现思路
基于上述领域的空白，本专利技术提供一种制备抗人L0C339524蛋白的单克隆抗体的方法，由该方法获得一株特异性好、效价高的产生抗人L0C339524蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。技术方案具体如下:一种制备抗人L0C339524蛋白的单克隆抗体的方法，包括如下步骤:(I)制备免疫原，(2)免疫动物，进行细胞融合得杂交瘤细胞，(3)培养杂交瘤细胞，分离杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，其特征在于:所述免疫原是氨基酸序列如Seq ID N0.5所示的重组融合蛋白。所述筛选原是氨基酸序列如Seq ID N0.6所示的重组融合蛋白。所述免疫动物指所述免疫原免疫Balb/c小鼠。所述免疫原与等量的弗氏完全佐剂乳化，乳化完成后，以四肢皮下多点注射加腹腔注射途径对Balb/c小鼠进行基础免疫，2周后，将免疫原与等量的弗氏不完全佐剂乳化，以四肢皮下多点注射加腹腔 注射途径对Balb/c小鼠进行追加免疫；2周后，再采用同样方式追加免疫一次。上述任一方法产生的杂交瘤细胞株。所述杂交瘤细胞株，名称为5-D3，保藏号为CCTCC C201330。一种抗L0C339524蛋白的单克隆抗体，由权利要求6所述的杂交瘤细胞株5_D3所分泌产生。所述的单克隆抗体的作为抗原抗体反应中识别L0C339524蛋白的抗体的用途。一种检测L0C339524蛋白的试剂盒，其特征在于，在采用酶联免疫原理检测L0C339524蛋白的试剂盒中，包被抗体采用权利要求7所述的单克隆抗体。本专利技术的第一贡献在于提供了一种制备抗L0C339524蛋白的单克隆抗体的方法，其要点在于:本专利技术设计并制备的免疫原及免疫方法能够有效制备出效价高、特异性好的单克隆抗体，具体如下:专利技术人从GENEBANK中获得人L0C339524蛋白的核苷酸编码序列(Seq ID N0.1)，通过分析选取L0C339524蛋白分子中第75-106位氨基酸的蛋白片段作为免疫单位，通过人工设计的连接蛋白基因序列将3段编码该免疫单位的基因序列连接起来获得L0C339524免疫蛋白基因序列(如Seq ID N0.4所示)。本专利技术通过将Seq ID N0.1及Seq ID N0.4所示的基因分别克隆原核表达载体PET32a中构建原核表达重组质粒。将重组质粒稳化到BL21 (DE3)中，表达人L0C339524重组蛋白及L0C339524免疫重组蛋白。本专利技术将L0C339524免疫重组蛋白作为免疫原免疫小鼠。将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞细胞进行融合，筛选得到杂交瘤细胞。。本专利技术的第二个贡献在于，基于上述方法，获得了一株经验证，并进行专利保藏的杂交瘤细胞株，能分泌相应的L0C339524蛋白特异性单克隆抗体，经亚类鉴定均为IgG2b，单抗效价均在1:20万以上，亲和力分别为7.2X IOkT1,特异性鉴定表明该株单克隆抗体均具有较高的特异性。保藏信息如下:分类命名:杂交瘤细胞株5-D3保藏号:CCTCCNo:C201330保藏日期:2013年3月10日保减单位:中国典型培养物保减中心保藏单位地址:中国武汉武汉大学430072基于本专利技术的以上贡献，本专利技术还请求保护上述方法产生的单克隆抗体以及单克隆抗体的用途。附图说明图1:逆转录获得cDNA为模板验证结果图2:PET32a-L0C339524 (1-274)的诱导表达经 SDS-PAGE 电泳分析结果。图3:L0C339524的糖基化预测结果。图4:L0C339524的B细胞线性表位的预测结果。图5:构建免疫原蛋白表达载体PET32a-L0C339524 (75-106)的验证。图6:连接成功的免疫原表达载体PET32a-L0C339524 (75-106)重组质粒双酶切鉴定。图7:为PET32a-L0C339524 (75-106)重组质粒转化BL21 (DE3)大肠杆菌进诱导表达及可溶性鉴定的SDS-PAGE电泳结果。图8:为PET32a-L0C339524(75-106)诱导蛋白的Ni亲和层析纯化的SDS-PAGE电泳结果。图9:为单克隆抗体5D3腹水的Protein G纯化监测图。 图10:为以ELISA法检测抗体的特异性及效价检测结果。其中鉴定抗原为梯度稀释的:PET32a_L0C339524 (1-274)重组蛋白、PET32a-L0C339524 (75-106)免疫重组蛋白、BSA和Trx-印pin融合蛋白。结果抗体5D3与L0C339524免疫原及检测原反应，但不与其他无关蛋白反应，抗体效价大于1:20万。图11:为用sigma抗体亚类试剂盒测定5_D3的亚类为IgG2b。图12:为单克隆抗体5-D3对人血清标本的Western_blot结果。图13:为单克隆抗体5-D3对人细胞株的荧光染色。图14:为单克隆抗体5-D3对人组织细胞的免疫组化染色。具体实施方式为让本专利技术的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。材料和来源实验动物:Balb/c小鼠购自第三军医大学实验动物中心(中国重庆)。细胞株、菌种及质粒:Sp2/0细胞株中国典型培养物保藏中心购买(CCTCC，中国上海)，PET32a质粒、BL21 (DE3)菌种为实验室保存。细胞培养基和胎牛血清购自Gibco公司，Lipo2000购自Novagen公司。酶及试剂盒:限制性内切酶NcoI及Xhol和质粒抽提试剂盒购自OMEGA公司，琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根公司。其它试剂:HRP-山羊抗小鼠IgG购自中山公司。实施例1.筛选原制备一L0C339524全长重组蛋白的制备1)L0C339524编码序列全基因获得根据GeneBank 提供的 L0C339524 基因序列(BC:126240.1)，确定人 L0C339524 蛋白基因拟克隆序列，如SEQ ID NO:1所不。设计L0C339524全长引物:分别为SEQ ID NO:1和2所示SEQ ID N0.2:L0C339524_1:5’ -CATGCCATGGCATCATTACAAGGGTGTGGGGTAC’ ；SEQ ID N0.3:L0C339524-2:5’ -CCGCTCGAGCAAAAGGCAACTTCTGGGGAAG-3’引物分别含酶切位点:L本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种制备抗人LOC339524蛋白的单克隆抗体的方法，包括如下步骤：（1）制备免疫原，（2）免疫动物，进行细胞融合得杂交瘤细胞，（3）培养杂交瘤细胞，分离杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，其特征在于：所述免疫原是氨基酸序列如Seq?ID?No.5所示的重组融合蛋白。
【技术特征摘要】
1.一种制备抗人L0C339524蛋白的单克隆抗体的方法，包括如下步骤: (1)制备免疫原， (2)免疫动物，进行细胞融合得杂交瘤细胞， (3)培养杂交瘤细胞，分离杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体， 其特征在于:所述免疫原是氨基酸序列如Seq ID N0.5所示的重组融合蛋白。2.根据权利要求1所述的方法，所述筛选原是氨基酸序列如SeqID N0.6所示的重组融合蛋白。3.根据权利要求1所述的方法，所述免疫动物指所述免疫原免疫Balb/c小鼠。4.根据权利要求3所述的方法，所述免疫原与等量的弗氏完全佐剂乳化，乳化完成后，以四肢皮下多点注射加腹腔注射途径对Balb/c小鼠进行基础免疫，2周后，将免...
【专利技术属性】
技术研发人员：李洪，
申请(专利权)人：李洪，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。