本发明专利技术公开了一种鲤鱼糖转运载体蛋白Sglt1兔抗血清的制备方法。本发明专利技术的技术方案要点为：鲤鱼糖转运载体蛋白Sglt1兔抗血清的制备方法，包括以下步骤：（1）克隆鲤鱼肠道糖转运载体蛋白Sglt1的基因；（2）构建糖转运载体蛋白Sglt1的基因工程菌；（3）糖转运载体蛋白Sglt1基因工程菌的诱导表达与鉴定；（4）制备糖转运载体蛋白Sglt1抗原；（5）免疫兔子；（6）采血样测定鲤鱼肠道糖转运载体蛋白Sglt1的效价；（7）颈动脉采血制备糖转运载体蛋白Sglt1的兔抗血清；（8）免疫组织化学方法检测。本发明专利技术采用表达跨膜蛋白的具有抗原决定簇部分基因片段作为抗原蛋白代替全长基因，解决了跨膜蛋白无法表达的难题。
Method for preparing rabbit antiserum to Sglt1 of sugar transporter protein
The invention discloses a preparation method of a rabbit antiserum to a carp sugar transporter protein Sglt1. Key points of the technical scheme of the invention is: the preparation method of sugar transporter protein of carp Sglt1 antiserum, which comprises the following steps: (1) cloning of carp intestinal sugar transport carrier protein Sglt1 gene; (2) constructing gene engineering strains sugar transporter Sglt1; (3) expression and identification of sugar transporter protein Sglt1 gene engineering bacteria; (4) preparation of glucose transporter protein Sglt1 antigen; immune rabbit (5); (6) the titer of blood and determination of carp intestinal sugar transport carrier protein Sglt1; (7) carotid artery blood preparation of rabbit antiserum against sugar transporter Sglt1; (8) immunohistochemical detection chemical method. The invention uses the partial gene fragment of the antigenic determinant with the expression of the transmembrane protein as the antigen protein to replace the full-length gene, and solves the problem that the transmembrane protein can not be expressed.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物制品
,具体涉及鲤鱼糖转运载体蛋白Sgltl兔抗血清的制备方法。
技术介绍
鲤鱼carpio),又称鲤拐子、鲤子,隶属于鱼纲,鲤形目，鲤科。其种类多，有红鲤、团鲤、草鲤、荷色鲤、锦鲤、火鲤、芙蓉鲤、荷包鲤等。鲤鱼对水体环境适应性强，是我国淡水养殖传统的优良品种。鲤鱼肠上皮细胞刷状缘膜上的钠/葡萄糖共转运载体(Na+/glUC0Secotransporter, Sgltl)是协助葡萄糖跨膜吸收的主要蛋白，在动物的生命活动中具有重要意义。Sgltl载体蛋白结合I mol葡萄糖和2 mol钠离子,形成Na+-载体-葡萄糖复合物，顺Na+浓度梯度进入细胞，随后由位于基底膜的葡萄糖易化转运载体2 (Glut2)将葡萄糖协助转运至血液。为了研究sWil基因表达和转运活性的调控因素及调控机理，需要高特异性的Sgltl抗体。Sgltl抗体可为Sgltl的组织定位、细胞定位、表达定量、鱼类糖代谢障碍等系列研究奠定物质基础。获得大量有活性的Sgltl蛋白作为免疫抗原是制备高活性抗体的关键。由于鲤鱼Sgltl蛋白是典型的跨膜蛋白，组织含量低，具有14个跨膜域，且其N端和C端位于胞外一侧，因此，不能有效地分离纯化及体外表达超量具有生物活性的Sgltl抗原蛋白成了制备Sgltl抗体的瓶颈。与本专利技术相关的现有技术一的技术方案是通过蛋白质分离纯化的方法，从组织中直接分离纯化Sgltl蛋白作免疫抗原。其缺点是细胞内蛋白一般含量很低，提取方法复杂，得到的蛋白量相对较少，含杂质多，需要复杂的纯化过程，成本高。与本专利技术相关的现有技术二的技术方案是通过构建工程菌体外表达外源蛋白作免疫抗原。其缺点是通过构建原核或真核表达系统来表达抗原蛋白，虽然体外表达的效率和表达量比较高，但是这种方法有很多的局限性，很多特殊结构异源基因如富含AT碱基和一些跨膜蛋白的基因很难在微生物中表达或者表达量很低，有的即使表达了但是没有活性。与本专利技术相关的现有技术三的技术方案是通过无细胞表达系统表达外源蛋白，无细胞表达系统是指以细胞裂解液为基础，加之外援的RNA模板、氨基酸和能量所构成的细胞外表达体系。其缺点是无细胞表达系统可以表达一些跨膜蛋白，但是这项技术在国内外还处于实验室研究水平，技术难度大，成本高，目前还无法实际应用。国内外已经完成了对鲤鱼Sgltl全长的测序工作，包括5'端非翻译区(5' UTR),3'端非翻译区(3' UTR)，一个2000bp左右的开放阅读框(0RF)。经序列同源性分析显示，Sgltl氨基酸序列具有高度保守性，鲤鱼Sgltl氨基酸序列和斑马鱼的相似性最高达90%以上，与兔子的Sgltl氨基酸序列相似性最低(低 于70%)。鲤鱼肠道I基因全长1977 bp,其Sgltl蛋白具有14个跨膜域，所以重组表达sgltl基因全长存在一定的困难。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题是提供了一种鲤鱼糖转运载体蛋白Sgltl兔抗血清的制备方法。本专利技术的技术方案是:鲤鱼糖转运载体蛋白Sgltl兔抗血清的制备方法，其特征在于包括以下步骤:(1)克隆鲤鱼肠道糖转运载体蛋白Sgltl的基因，通过分析膜蛋白Sgltl的三维结构、跨膜区和抗原决定簇，利用原核表达具有抗原决定簇的部分Sgltl基因片段作为免疫抗原蛋白代替表达全长基因；(2)构建糖转运载体蛋白Sgltl的基因工程菌；(3)糖转运载体蛋白Sgltl基因工程菌的诱导表达与鉴定；(4)制备糖转运载体蛋白Sgltl抗原；(5)免疫兔子；(6)采血样测定鲤鱼肠道糖转运载体蛋白Sgltl的效价；(7)颈动脉采血制备糖转运载体蛋白Sgltl的兔抗血清；(8)免疫组织化学方法检测。本专利技术所述的制备糖转运载体蛋白Sgltl抗原的具体步骤为:将步骤(3)诱导表达的菌液离心，弃上清，按照湿重I g的菌体加6 ml蒸馏水，吹打混匀，再加入与上述菌体混合液等体积的2 X SDS-PAGE上样缓冲液，混匀，沸水浴10 min,使蛋白变性，进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后将分离胶放于0.3 M KCl溶液里染色，显示目的条带，切下分离胶上的目的蛋白条带，放入ddH20里清洗，将胶条剪碎放入塑料培养皿中，冷冻干燥I d，放入研钵中磨成粉末，每200 mg目的蛋白粉加3 ml生理盐水溶解蛋白，离心，取上清，用超微量分光光度计检测蛋白浓度。本专利技术所述的免疫兔子的具体步骤为:按注射要求将蛋白溶液稀释；乳化:耳缘静脉注射:0.8 ml蛋白溶液+0.4 ml完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂，漩涡震荡，皮内注射:1 ml蛋白溶液+1 ml不完全弗氏佐剂，漩涡震荡；注射方法:第一、二次采用耳缘静脉注射法，第三、四次采用皮内多点注射法；每隔10 d加强免疫I次，第I次免疫加完全弗氏佐齐U，以后加强免疫时用不完全弗氏佐剂。`本专利技术所述的颈动脉采血制备糖转运载体蛋白Sgltl的兔抗血清的具体步骤为:步骤(5)中第四次免疫后8 d颈动脉采血，兔子在采血前禁食I d，采集血样收集于经灭菌并不含抗凝剂的离心管中，室温放置2 h，待血液凝块后，4 °C保存使之凝固，析出淡黄色抗血清，将抗血清转移至另一管中，血凝块以1500 rpm离心10 min，吸出上清液合并于收集到的抗血清管中，分装冷冻干燥保存，部分放于4 °C备用。本专利技术采用表达跨膜蛋白的具有抗原决定簇部分基因片段作为抗原蛋白代替全长基因，解决了跨膜蛋白无法表达的难题，并且该方法简单易行，快速，稳定，成本低，周期短，表达量高，制备的抗体特异性强，效价高。附图说明图1是本专利技术制备方法的流程图，图2是鲤鱼全长Sgltl基因PCR扩增产物的电泳分析图，图3是鲤鱼部分Sgltl基因Sgltl-P PCR扩增产物的电泳分析图，图4是重组Sgltl-P SDS-PAGE电泳分析图，图5是鲤鱼肠道Sgltl表达的免疫组织化学检测结果图(100 X)。具体实施例方式结合附图详细描述实施例。1.鲤鱼肠道Sgltl的克隆与表达 (I) PCR引物设计 利用Primer Primern 5.0设计两对引物,基于本实验室已获得的鲤鱼肠道5^7(7基因的全长序列，设计一对特异性引物sgltl - F和sgltl - R:sgltl - F:5’-ATGGGTGAAGAATATTTTGG-3’sgltl - R:5，-TTAGCCAAAGAAACCATGG-3’ 另一对为含I RHindlll双酶切位点的特异性引物5^/i7-F2和5^7i7_G2: Sgltl-VZ:5’-GGAATTCAAACCCATTGACGACAAA-3’ sgltl-G2:5’-CCCAAGCTTGTTTCTCCATAGCGGT-3’ 划线部分分别为IRHindUl的酶切位点。(2)全长基因的克隆与序列分析 采用Trizol法提取鲤鱼前肠组织总RNA，用Oligo (dT) 18引物进行反转录合成cDNA。以cDNA为模板，采用sgltl - F和sgltl - R引物进行PCR扩增，反应条件为95°C 3 min, 94°C50s, 52.4°C 50s, 72 °C 2min 10s，30 个循环，72°C lOmin，14°C 保温。PCR 产物进行 L0% 琼脂糖凝胶电泳分析。扩增到了大约2000bp左本文档来自技高网...
【技术保护点】
鲤鱼糖转运载体蛋白Sglt1兔抗血清的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）克隆鲤鱼肠道糖转运载体蛋白Sglt1的基因，通过分析膜蛋白Sglt1的三维结构、跨膜区和抗原决定簇，利用原核表达具有抗原决定簇的部分Sglt1基因片段作为免疫抗原蛋白代替表达全长基因；（2）构建糖转运载体蛋白Sglt1的基因工程菌；（3）糖转运载体蛋白Sglt1基因工程菌的诱导表达与鉴定；（4）制备糖转运载体蛋白Sglt1抗原；（5）免疫兔子；（6）采血样测定鲤鱼肠道糖转运载体蛋白Sglt1的效价；（7）颈动脉采血制备糖转运载体蛋白Sglt1的兔抗血清；（8）免疫组织化学方法检测。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：聂国兴，张建新，王俊丽，侯彩霞，闫潇，张新胜，
申请(专利权)人：河南师范大学，
类型：发明
国别省市：
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