一种抗杂色曲霉素的单克隆抗体制造技术

本发明专利技术公开了一种抗杂色曲霉素的单克隆抗体，所述抗体包括轻链和重链，其中轻链可变区氨基酸如序列表SEQ?ID?NO.1所示，重链可变区氨基酸序列如序列表SEQ?ID?NO.2所示，本发明专利技术公开了制备上述抗体的方法。利用本发明专利技术所述的抗体制备了检测杂色去霉素的检测试剂盒，所述试剂盒的灵敏度达10pg/μl，可有效检测样品中杂色曲霉素的含量。本发明专利技术所述的试剂盒使用方便，不需贵重仪器，便于大范围推广使用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种单克隆抗体，具体而言涉及抗杂色曲霉素单克隆抗体ASH，还涉及该单克隆抗体在制备杂色曲霉素检测试剂盒中的应用。
技术介绍
目前已知污染谷物的霉菌毒素约有100种，霉菌毒素是霉菌的代谢次生物。饲料中的霉菌毒素除了引起动物霉菌毒素中毒，大部分还可抑制动物免疫，降低抵抗力，从而诱发其他疾病。动物试验表明:霉菌毒素能引起心率减慢、呼吸加快、脱毛和流广等症状。霉菌毒素还可在畜产品中残留，间接危害人类健康。杂色曲霉素(Sterigmatocys简称ST)是一种杂环化合物具有很强的肝及肾脏毒素，能诱发多种肿瘤。南非某些地区的肝癌高发可能与ST有关。杂色曲霉素是，可导致胆管癌和肝癌，有致突变 性，但对食品的污染频率较低。ST还可转化成更强烈的致癌物黄曲霉毒素。ST还能引起一些动物疾病。ST可有10多种真菌代谢产生，在人工培养基的产量高达10g/kg。已知可被ST污染的食品包括:大米、小麦、玉米、花生、大豆、火腿、奶酪、咖啡等。杂色曲霉素经三氯化铝喷雾后加热，可在365nm波长紫外光下呈黄色荧光。卫生研究所建立的检测杂色曲霉素的薄层色谱法已于1984年列为国家标准(GB/T5009.25-1996)。该法对大米、玉米、小麦的最低检出量为25 μ g/kg,黄豆、花生为50 μ g/kg。由于ST危害大，分布广，要减少其对人畜的影响，有效而快速的检测食物及饲料中的ST就显得非常重要。确诊ST中毒则更有赖于从患者的组织或分泌物、排泄物中检出。与传统应用的生物学检测法、薄层层析法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)等相比，免疫化学检测法对真菌毒素的检测具有快速、特异、灵敏、准确、可以批量检测、样品处理简单、能实现自动化操作等优点。而免疫化学检测ST的前提则是需要具备针对ST的抗体。以食品的天然组分形式存在的天然霉菌毒素则不易被识别，且由于潜在毒性大，从而会对消费者的健康造成很大的威胁。越早进行霉菌毒素检测就越容易将霉菌毒素产生的危害降到最低。如能从源头就发现霉菌毒素，则更便于及早采取合理的措施控制霉菌毒素，以免受霉菌毒素污染的饲料给养殖业带来危害，从而使企业包括食品安全蒙上阴影。实际操作中，如果在饲料原料采购环节就采用快速筛选的方法，查看饲料原料是否含有霉菌毒素，则可以使企业避免使用含霉菌毒素的原料生产饲料。所以，研制对霉菌毒素快速、高灵敏、高特异性的检测方法显得尤为重要。
技术实现思路
本专利技术公开了一种抗杂色曲霉素单克隆抗体ASH，所述单克隆抗体包括轻链和重链，其氣基酸可变区序列分别如序列表中SEQ ID NO:I和SEQ ID NO:2所不。本专利技术还公开了上述单克隆抗体ASH的制备方法，主要包括如下:1.抗杂色曲霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建I)抗原的制备(BSA-ST)将ST与稀硫酸在热水浴中回流衍生成ST半缩醛衍生物，ST半缩醛衍生物经过硅胶G层析柱纯化后在中性磷酸盐缓冲液中(PBS)与牛血清白蛋白(BSA)反应5小时，低温下加入NaBH4还原，再用稀盐酸除掉过量的NaBH4，然后兑水透析，备用。由此得到复合抗原BSA-ST,分装冻干，免疫动物。用紫外吸收光谱确定BSA与ST的偶联率。2)动物免疫5只BABLC用BSA-ST进行免疫，200 μ g/只/次，免疫4次，进行小鼠尾血效价测定。最终要求ELISA效价达到1: 25600以上。3)饲养层细胞制备(融合前一天制备完成)将未经免疫的小鼠(BALB/C或昆明小鼠)拉颈处死，摘除眼球取血。将未经免疫的小鼠用75%酒精浸泡消毒，取出后放在超净工作台内的无菌培养皿中。剪开小鼠腹部皮肤(不要损伤腹膜)、沿切口上下撕开皮肤，充分暴露腹部，换剪刀、镊子，剪开腹膜，切口大小可以允许尖吸管随意进出，取一只尖端平整的尖吸管吸一管培养液，加到小鼠腹腔中，涮一涮，吸出，反复几次(一般2 3次)，注意不要戳破小鼠消化道，污染细胞。离心收集的饲养层细胞，弃上清，将细胞悬于HAT培养液中，台盼蓝染色计数活细胞，根据活细胞量进行稀释，使每毫升含约40万个活细胞。混匀后倒入灭过菌的排枪槽用排枪将细胞悬液加于96孔培养板的小孔中(或用滴管滴入96孔培养板的小孔)37°C，饱和湿度的培养箱中培养备用。4)免疫脾细胞的制备免疫的BALB/C小鼠，眼球取血，作为阳性对照用。免疫的BALB/C小鼠用75%酒精浸泡消毒，取出后放在超净工作台内的无菌培养皿中，剪开并充分剥离腹部皮肤，换一套无菌镊子和剪子提起腹膜，剪开一小口，再换一套无菌镊子和剪子，用剪刀分离脾脏，尽量不要带结缔组织，将脾脏转移到培养皿内的细胞筛上，用剪刀剪开脾脏，用20ml玻璃注射器活塞轻轻挤压脾脏，用滴管吸取无血清1640培养基冲洗活塞和钢网，反复几次上边操作，直至脾脏仅剩包膜。将滤液离心用无血清1640培养基悬浮细胞，取少量脾细胞悬液进行台盼蓝细胞计数，检测活细胞比例(应大于80 % )，确定活脾细胞的数量，根据脾细胞的数量，按5: I 10:1准备SP2/0骨髓瘤细胞，(一只小鼠脾细胞大约IO8个，用SP2/0骨髓瘤细胞 2 X IO7 个，融合用 50% PEG40001ml)。5)骨髓瘤细胞悬液在融合前7 10天将冻存在液氮中的骨髓瘤细胞复苏，培养I 2代。选择生长旺盛、形态良好的细胞进行扩大培养。在细胞融合当天收集处于对数生长期的细胞，对收集的细胞进行细胞计数和细胞活力检测。透亮不着色的活细胞应占90%以上。计数后，根据脾细胞的数量，按5:1 10:1吸取相应数量的骨髓瘤细胞悬液注入灭菌的50mL离心管中备用(2 X IO7个骨髓瘤细胞)。6)细胞融合及培育 将装PEG4000的玻璃离心管置于酒精灯上，熔化后稍冷却，加入0.5ml无血清1640，混匀，即为50% PEG4000，37°C水浴平衡温度备用。将准备好的脾细胞、骨髓瘤细胞两种细胞悬液充分混匀后离心。再用RPM1-1640培养液洗一次。将上清倒干(或用滴管吸净残留液体)，以免影响PEG的浓度。用手指轻轻弹松沉淀细胞团，使两种细胞混匀成糊状。将离心管置于37°C水浴中，缓慢加入lmL37°C预热的50% PEG4000边加边搅匀，Imin完成。静置lmin，然后将一吸管无血清培养液在Imin内加入细胞中，动作尽量轻柔，边加边搅，最后补液至20ml。离心弃上清液，将细胞轻轻悬于20%进口胎牛RPMI1640HAT培养基中。铺96孔板5块。第二天检查是否污染，第五天计算融合率，第七天换液，以后每隔3 4天换液一次，第十天检测阳性克隆。每天观察每孔克隆生长情况，做好记录，换液时，吸出一半的培养液，加入新的培养基，骨髓瘤细胞完全被杀死后，改用HT培养基。通过上述方法获得可表达抗杂色曲霉素抗体的细胞，其表达的抗杂色曲霉素抗体命名为ASH。2.抗杂色曲霉素抗体ASH的轻、重链基因的钓取通过ELISA的方法检测杂交瘤细胞的上清，筛选出能够和杂色曲霉素结合的细胞株，提取筛选的细胞株的细胞RNA，经RT-PCR，用两对特异性引物钓取抗体的轻重链基因。常规法连接入载体，转化感受态细菌，培养后挑取单个菌落，提取质粒PCR鉴定后进行DNA测序分析。通过上述步骤，构建了含有抗杂色曲霉素抗体ASH轻、重链基因的载体，经测序得到杂色曲霉素抗体ASH轻、重链基因信息，轻链其氨基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗杂色曲霉素单克隆抗体，包括轻链和重链，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ?ID?NO：1所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ?ID?NO：2所示。

【技术特征摘要】
1.一种抗杂色曲霉素单克隆抗体，包括轻链和重链，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO:2所示。2.权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测杂色曲霉素的试剂、药剂或试剂盒中的应用。3.—种检测杂色曲霉素试剂盒包括:权利要求1所述的抗体、抗杂色曲霉素ASPl抗体，其中所述ASPl抗体其轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0:4所示。4.根据权利要求3所述的检测杂色曲霉素试剂盒，其特征在于，所述的抗杂色曲霉素ASPl抗体带有生物标记或化学标记,所述生物标记或化学标记为突光标记、放射性标记或酶标记。5.根据权利要求3所述的检测杂色曲霉素试剂盒，其特征在于，所述的抗杂色曲霉素ASPl抗体为辣根过氧化酶标记。6.权利要求5所述的检测杂色曲霉素试剂盒还包括:辣根过氧化物酶底物缓冲液、ST标准品(100ug/ml，0.1ml)、阴性对照样品...

【专利技术属性】
技术研发人员：江飞剑，王海彬，杨承刚，韦国栋，
申请(专利权)人：中国人民共和国台州出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：