用于检测黄曲霉毒素及杂色曲霉素的生物传感器电极及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种用于检测黄曲霉毒素及杂色曲霉素的生物传感器电极，以及该生物传感器电极的制备方法。本发明专利技术所述的用于检测黄曲霉毒素及杂色曲霉素的生物传感器电极，包括基底层与在基底层上形成的反应层，所述的反应层包含电子介体和黄曲霉毒素解毒酶，电子介体固定在基底层上成膜，该膜作为酶载体联结黄曲霉毒素解毒酶，形成黄曲霉毒素解毒酶修饰电极。本发明专利技术利用发明专利技术人报道的黄曲霉毒素解毒酶首次制备出生物传感器电极，与现有技术相比，具有响应快、信号灵敏、特异性高、使用方便、可定量检测等优点。本发明专利技术所述的生物传感器电极的灵敏度可达到１ｐｐｍ～１０ｐｐｂ的水平。本发明专利技术省时、省力，操作简单，几乎无须培训即可推广应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物传感器领域，涉及一种用于检测黄曲霉毒素及杂色曲霉素的生物传感器电极，以及该生物传感器电极的制备方法。
技术介绍
黄曲霉毒素(AFT)、杂色曲霉素(ST)是目前已知的强致癌物之一，它们常污染动物饲料和人类的食品。用污染的饲料喂养禽畜会导致肉、乳及其制品的污染。人们如果食用被污染的食品，会导致急性中毒，引起肝脏坏死出血，慢性中毒可引起肝癌、肺癌。同时，用被污染的饲料饲养禽畜会使禽畜生产率降低，增重减慢，造成重大经济损失。各国对食品及饲料中的黄曲霉毒素均有严格的限量规定。杂色曲霉素是结构与黄曲霉毒素十分相似的霉菌毒素，其毒性、致癌性与黄曲霉毒素相似，因此对于食品及饲料中的杂色曲霉素各国也有严格的规定。目前，对食品及饲料中黄曲霉毒素的检测方法大致有TLC(薄层色谱法)、HPLC(高效液相色谱)、ELISA(酶联免疫吸附分析)等几种(黄曲霉毒素B1检测方法的分析，食品与发酵工业2003年10期)。TLC法较为简单，不需要价格高昂的仪器设备，但样品的前处理繁琐，提取效果不理想，操作费时。HPLC法需要高昂的设备费用，专业的操作人员。ELISA法也需要专业的技术人员，需要专门的设备，还需要购买昂贵的试剂盒，仅适合于批量的检验，操作费时，需约4小时。而对于食品及饲料中黄曲霉毒素、杂色曲霉素的检测方法，则未见详细报道。多壁碳纳米管自从1991年问世以来，由于其独特的物化特性以及所具有的纳米颗粒的大比表面积赋予了其在酶生物传感器研制方面无可比拟的优点。其纳米颗粒的大比表面积可以大大提高固化酶的数量，增加酶与底物反应的面积，从而大大提高酶生物传感器的响应性，并且其具有独特的金属或导体的性质，能在电极表面迅速传递电子，从而促进电极表面的电流响应，提高传感器的灵敏度。另外一个引人注目的优点是碳纳米管在酸氧化环境下经活化后，能在碳纳米管表面引入活性的功能基团-COOH，-OH，-CHO等基团，利用其这一特性可通过蛋白交联剂EDC、NHS将带有-NH2，-COOH的蛋白酶通过缩和反应共价结合在碳纳米管载体上，以固相酶的形式保持酶活力，从某种程度上大大节约酶用量和损失。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于检测黄曲霉毒素及杂色曲霉素的生物传感器电极。本专利技术所述的用于检测黄曲霉毒素及杂色曲霉素的生物传感器电极，包括基底层与在基底层上形成的反应层，所述的反应层包含电子介体和黄曲霉毒素解毒酶，电子介体固定在基底层上成膜，该膜作为酶载体联结黄曲霉毒素解毒酶，形成黄曲霉毒素解毒酶修饰电极。所述的电子介体可选用有机分子电子介体和高分子电子介体。有机分子电子介体主要有二茂铁及其衍生物、有机染料、醌及其衍生物、四硫富瓦烯；高分子介体主要包括变价过渡金属离子型和有机氧化还原型等氧化还原聚合物。高分子介体化合物通常是由低分子介体化合物与高分子链所带的活性基团进行反应固载生成的。本专利技术优选的电子介体由在酸氧化环境下活化的多壁碳纳米管构成，其通过蛋白交联剂联结黄曲霉毒素解毒酶。活化后的多壁碳纳米管起了一个增敏的作用，即增强电极的灵敏性，同时，活化后的多壁碳纳米管具有较大量的羧基，这十分有利于对蛋白质的固定。所述的多壁碳纳米管优选是以硝化氧化方式活化处理所得的羧基化多壁碳纳米管，也可以是其他强酸或强氧化剂活化处理所得的羧基化多壁碳纳米管。所述的蛋白交联剂为EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺)、NHS(N-羟基丁二酰亚胺酯)，也可以为其它的联结蛋白质的方式。当选用其他不同的电子介体时，可选用适合该电子介体的不同的联结方法。例如，选用二茂铁衍生物作为电子介体时，先利用双异硫氰酸酯与酶分子进行交替共聚制成酶膜，然后再将带有羧基的二茂铁衍生物通过与酶分子上的氨基反应键合到酶分子上去。本专利技术的另一目的在于提供一种用于检测黄曲霉毒素及杂色曲霉素的生物传感器电极的制备方法。本专利技术所述的一种用于检测黄曲霉毒素及杂色曲霉素的生物传感器电极的制备方法，包括以下步骤A、将多壁碳纳米管进行羧基化的活化处理，加表面活性剂促溶并配成羧基化多壁碳纳米管溶液；B、制备黄曲霉毒素解毒酶；C、以羧基化多壁碳纳米管溶液对基底层进行修饰成膜，在黄曲霉毒素解毒酶的酶液中加入适量的底物即杂色曲霉素粉末和/或黄曲霉毒素粉末，底物的加入量足以保护黄曲霉毒素解毒酶的活性中心，混匀，滴加于电极表面，羧基化多壁碳纳米管联结黄曲霉毒素解毒酶，得到黄曲霉毒素解毒酶修饰的生物传感器电极。所述的步骤C中，滴加于电极表面的黄曲霉毒素解毒酶酶液中还加入适量的稳定剂，如PEG、甘油、吐温等。稳定剂的加入量与酶液的体积比为1∶10。优选的制备方法包括以下步骤A、羧基化多壁碳纳米管溶液的制备将多壁碳纳米管用王水回流8～12小时，离心，弃上清，干燥后为羧基化多壁碳纳米管；称取羧基化多壁碳纳米管溶于二甲基甲酰胺中，超声波搅拌均匀后，配成0.01～1.0mg/ml的羧基化多壁碳纳米管溶液；B、黄曲霉毒素解毒酶的制备采用Armillariella sp.菌体破碎提取法制得黄曲霉毒素解毒酶，或者采用基因工程方法获得黄曲霉毒素解毒酶；配制成蛋白浓度为0.2mg/ml的酶液，备用；C、多壁碳纳米管修饰酶电极的制备以金电极为基底层，打磨至光亮，并依次在丙酮，强碱溶液，强酸溶液以及蒸馏水中超声波清洗，将步骤A所得的羧基化多壁碳纳米管溶液滴加在电极表面，烘干成膜；再依次分别浸入100g/L的EDC溶液和100g/L的NHS溶液中30分钟；取步骤B所得的酶液100μl加入0.01～0.5μg的底物即杂色曲霉素粉末和/或黄曲霉毒素粉末，混匀，滴加于电极表面，15～25℃放置30分钟后，在用于配制EDC溶液和NHS溶液的PBS溶液中清洗数次；将电极置于黄曲霉毒素解毒酶酶液中0～4℃下12～24小时，用PBS缓冲液冲洗电极数次，洗去电极表面未固定上的酶，即得到黄曲霉毒素解毒酶修饰的生物传感器电极。所述的步骤C中，每100μl酶液中还加入10μl的稳定剂PEG-200，混匀，然后滴加于电极表面。更为优选的制备方法包括以下步骤A、羧基化多壁碳纳米管溶液的制备将多壁碳纳米管用王水回流8～10小时，10000g离心15分钟，弃上清，用双蒸水清洗沉淀，10000g离心15分钟，洗涤沉淀，重复此步骤两次；将沉淀置于烘箱中烘干，为羧基化多壁碳纳米管；称取上述1mg羧基化多壁碳纳米管溶于10ml的二甲基甲酰胺中，超声波搅拌均匀后，配成0.1mg/ml的溶液；B、黄曲霉毒素解毒酶的制备采用Armillariellla sp.菌体破碎提取法制得黄曲霉毒素解毒酶，或者采用基因工程方法获得黄曲霉毒素解毒酶；配制成蛋白浓度为0.2mg/ml的酶液，备用；C、多壁碳纳米管修饰酶电极的制备将金电极以牙膏、硅藻土在绒布上打磨至光亮，并依次在丙酮、0.5mol的NaOH溶液、1∶1浓硝酸以及双蒸水中超声波清洗，每次3～5分钟，将10μl羧基化多壁碳纳米管溶液滴加在电极表面，置于60℃烘箱中烘干成膜。然后，再依次分别浸入100g/L的EDC溶液和100g/l的NHS溶液中30分钟，EDC溶液和NHS溶液均以0.01M，pH7.4PBS配制；取步骤B所得的酶液100μl加入0.01～0.5μg的底物即杂色曲霉素粉末和/或黄曲霉毒素粉末，在振荡本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测黄曲霉毒素及杂色曲霉素的生物传感器电极，包括基底层与在基底层上形成的反应层，其特征在于：所述的反应层包含电子介体和黄曲霉毒素解毒酶，电子介体固定在基底层上成膜，该膜作为酶载体联结黄曲霉毒素解毒酶，形成黄曲霉毒素解毒酶修饰电极。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：姚冬生，刘大岭，文圣梅，谢春芳，郑文杰，
申请(专利权)人：广州科仁生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]