用于快速检测杂色曲霉素的生物传感器及其组装方法技术

本发明专利技术公开一种用于快速检测样品中杂色曲霉素的生物传感器及其组装方法，所述的生物传感器包括基底电极以及组装在基底电极上的反应层，所述的反应层包括聚合物膜，电子传递体，壳聚糖凝胶和６－甲氧基双呋喃香豆素氧化酶。６－甲氧基双呋喃香豆素氧化酶固定在电子传递体－壳聚糖混合膜中，再组装在聚合物膜修饰的基底电极上，即得用于检测杂色曲霉素的生物传感器。本发明专利技术的生物传感器灵敏度高，响应时间快，抗干扰能力强，对杂色曲霉素的检测下限达到３ｎｇ／ｍＬ，能用于实际样品检测，其平均回收率为９５．８％。该生物传感器制作简单，使用方便，稳定性好，使用寿命长，为实现实际样品中杂色曲霉素含量的快速检测提供了一种新的检测手段。

Biosensor for rapid detection of Aspergillus versicolor and assembly method thereof

The invention discloses a method for biosensor and its assembling method for rapid detection of sterigmatocystin in biological sensor comprises a substrate and electrode assembly in a reaction layer on the electrode, the reaction layer comprises a polymer film, electron transfer, chitosan gel and 6 methoxy double furanocoumarins oxidase. 6 - methoxy bis - furan coumarin oxidase is immobilized in the electron transfer chitosan composite membrane and then assembled on the polymer membrane modified base electrode. The sensitivity of the biosensor of the present invention is high, fast response time, strong anti-interference ability, the detection limit of Aspergillus versicolor pigment reached 3ng / mL, can be used in practical test, the average recovery rate was 95.8%. The biosensor has the advantages of simple production, convenient operation, good stability and long service life, and provides a new detection method for the rapid detection of the content of the Aspergillus in the actual sample.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物传感器领域，涉及一种。
技术介绍
杂色曲霉素(Sterigmatocystin， ST)是一种致癌致畸的真菌毒素，是黄曲霉毒素 (Aflatoxin， AFT)的合成前体，二者结构相似，都是由双呋喃环与氧杂蒽醌连接组成。ST 是国际癌症研究机构划分的2B类致癌物质，与肺癌、肝癌、胃癌密切相关，是粮食、饲草、玉 米、小麦、花生等谷物中的主要真菌污染源。在我国，恶性肿瘤高发区大部分是由于粮食 和谷物中ST的污染，然而，人们对ST的急慢性毒性认识却比较少，因此测定ST的含量具 有重要的意义。目前，测定ST的方法主要有薄层层析法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、 液质联用法(LC-MS)、气质联用法(GC-MS)和偶联质谱法(Tandem MS)等(Turner丽， Subrahmanyam S， Piletsky SA. Analytical methods fordetermination of mycotoxins: A review. Anal Chim Acta 2009;632:168-180.)。这些方法各有其特点，但有的需要使用 昂贵的仪器，有的操作繁琐，有的样品前处理麻烦；此外，由于ST发荧光的强度远不如黄曲 霉毒素，而使用衍生化的方法则容易引入较大的误差，灵敏准确的检测通常需要使用质谱 检测器，从而难于实现实际样品中ST含量的快速检测。 酶生物传感器是一种较好的替代方法，具有检测速度快，操作简单等特点，已报 道的酶生物传感器法，如在专利技术人的中国专利ZL 200410028018.9中，提供了利用黄曲霉 毒素解毒酶修饰电极制备生物传感器检测杂色曲霉素，其检测线为10ng/mL，响应时间为 2min。但该类生物传感器仍有待改进，提高其灵敏度、稳定性和重现性等。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种可用于实际样品中杂色曲霉素 含量快速检测的生物传感器。该生物传感器灵敏度更高，稳定性和重现性更好，响应时间更 快，并且可快速用于实际样品中ST检测的生物传感器及其组装方法。 本专利技术所述的一种用于快速检测杂色曲霉素的生物传感器，包括基底电极以及组 装在基底电极上的反应层，所述的反应层包括聚合物膜，由电聚合在基底电极上的聚邻苯 二胺构成；该聚合物膜修饰在所述基底电极上；电子传递体，为有机分子或高分子电子传 递体；壳聚糖凝胶，由壳聚糖溶液制成；以及6_甲氧基双呋喃香豆素氧化酶；其中，由活化 后的单壁碳纳米管均匀分散在壳聚糖溶液中形成电子传递体_壳聚糖凝胶混合膜；所述 6_甲氧基双呋喃香豆素氧化酶包埋固定在电子传递体_壳聚糖凝胶混合膜上，再组装在聚 合物膜修饰的基底电极上，形成用于检测杂色曲霉素的生物传感器。 本专利技术优选的聚合物膜是聚邻苯二胺，邻苯二胺可以通过电聚合，有机合成等方 法在很多导电基体上制得聚合薄膜，它即适合于在有机电解质中使用，也可以用于水性电 解质溶液，具有较高的库伦效率和稳定性。4 本专利技术所述的电子传递体可选用有机分子或高分子电子传递体。有机分子电子传 递体主要有二茂铁及其衍生物、有机染料、醌及其衍生物、离子液体等；高分子电子传递体 主要有碳纳米管、金属纳米颗粒、变价过渡金属离子型和有机氧化还原型等氧化还原聚合 物等。本专利技术优选的电子传递体是活化后的单壁碳纳米管，可以采用强酸或强氧化剂进行 活化处理。本专利技术中将单壁碳纳米管分散在壳聚糖溶液中，也可以选用溶胶凝胶(sol-gel) 及其复合物、明矾以及一些其他具有成膜能力的化合物代替壳聚糖。 本专利技术所述的一种用于快速检测杂色曲霉素的生物传感器的组装方法，包括以下 步骤 A、将邻苯二胺单体通过电化学的方法聚合在基底电极表面，得到聚邻苯二胺聚合 物膜修饰的基底电极； B、将壳聚糖溶液制成壳聚糖凝胶； C、将单壁碳纳米管活化处理后，加入到上述的壳聚糖溶液中混匀，即得单壁碳纳 米管-壳聚糖混合液，备用； D、制备6-甲氧基双呋喃香豆素氧化酶溶液，备用； E、将6-甲氧基双呋喃香豆素氧化酶溶液与单壁碳纳米管_壳聚糖混合液混匀，滴加在聚邻苯二胺聚合物膜修饰的基底电极表面，4t:组装过夜，即得所述的生物传感器。 优选的制备方法包括以下步骤 a、聚邻苯二胺修饰基底电极的制备 清洗干净的基底电极在使用前先在112504中进行电化学预处理，用循环伏安法进 行扫描直到电极信号稳定为止；处理好的基底电极插入到氮气饱和的含0. 01-0. 05mol/L 邻苯二胺的O. 1-0. 5mol/L !12504电聚合液中，以0. 05-0. 1V/s的扫速循环伏安电聚合30-60 圈，即可在基底电极表面形成一层聚邻苯二胺膜； b、壳聚糖溶液的制备 用乙酸溶解壳聚糖粉末，使其浓度在O. 1% _1.5%之间，充分溶解后滤去不溶杂 质，调节壳聚糖溶液的pH值为5.5，置于4t:保存备用； c、单壁碳纳米管_壳聚糖混合液的制备 用强酸或强氧化剂活化单壁碳纳米管，洗至中性烘干后溶于步骤b所制得的壳聚 糖溶液，超声分散，制得分散均匀的0. lmg/mL-2. 5mg/mL的单壁碳纳米管_壳聚糖溶液； d、6_甲氧基双呋喃香豆素氧化酶的制备 将克隆有甲氧基双呋喃香豆素氧化酶的基因工程大肠杆菌诱导表达，收集菌体， 超声破碎细胞后用亲和层析柱进行纯化，酶切融合蛋白得到单一的6-甲氧基双呋喃香豆素氧化酶；层析纯化酶切产物，收集色谱过程中的酶活性峰组分，浓縮后得e-甲氧基双呋喃香豆素氧化酶；配制成蛋白浓度为2mg/mL的酶液，备用； e、6_甲氧基双呋喃香豆素氧化酶修饰的生物传感器的制备 取步骤c中所制备的单壁碳纳米管_壳聚糖混合液滴加在步骤a中聚邻苯二胺修 饰的基底电极上，室温下晾干成膜；然后再滴加步骤d中所制备的酶液，4t:组装过夜，即得 6_甲氧基双呋喃香豆素氧化酶修饰的生物传感器。 本专利技术所述的生物传感器主要是利用6-甲氧基双呋喃香豆素氧化酶作为分子识 别原件来检测杂色曲霉素(ST)，其原理是ST在6-甲氧基双呋喃香豆素氧化酶的催化作用下发生氧化还原反应，随着电子的转移，产生可被检测的电信号。本专利技术所述的生物传感 器，对于杂色曲霉素的检测是高特异性，高选择性和高灵敏性的，完全能满足实际样品中杂 色曲霉素含量的检测。 与现有技术相比，本专利技术所述的生物传感器具有如下有益效果 (1)利用本专利技术所述的生物传感器可实现对实际样品的快速检测，只需对实际样 品进行简单的预处理，就可以实时在线监控，其响应时间快，小于10s，对ST响应更灵敏； (2)本专利技术所述的生物传感器灵敏度更高，在0. lmol/L pH7. 0的PBS检测体系中 对ST检测的下限为3ng/mL，线性范围宽，为10ng/mL-310ng/mL ; (3)本专利技术所述的生物传感器具有很好的稳定性和重现性；抗干扰能力强，能够 快速实现单个或批量样品的检测；检测实际样品的回收率为87. 6-105. 5%，检测速度快， 稳定好，使用寿命长； (4)本专利技术所述的生物传感器使用起来省时、省力，检测速度快且操作简单方便， 无须培训即可推广使用。附图说明 图1为MDCO/CS-SWCNTs/POPD/Au修饰电极在含不同浓度ST的PBS中的循环伏安 曲线；其中，图中曲线从a到本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于快速检测杂色曲霉素的生物传感器，包括基底电极以及组装在基底电极上的反应层，其特征在于，所述的反应层包括：聚合物膜，由电聚合在基底电极上的聚邻苯二胺构成；该聚合物膜修饰在所述基底电极上；电子传递体，为有机分子或高分子电子传递体；壳聚糖凝胶，由壳聚糖溶液制成；以及６－甲氧基双呋喃香豆素氧化酶；其中，由活化后的单壁碳纳米管均匀分散在壳聚糖溶液中形成电子传递体－壳聚糖凝胶混合膜；所述６－甲氧基双呋喃香豆素氧化酶包埋固定在电子传递体－壳聚糖凝胶混合膜上，再组装在聚合物膜修饰的基底电极上，形成用于检测杂色曲霉素的生物传感器。

【技术特征摘要】
一种用于快速检测杂色曲霉素的生物传感器，包括基底电极以及组装在基底电极上的反应层，其特征在于，所述的反应层包括聚合物膜，由电聚合在基底电极上的聚邻苯二胺构成；该聚合物膜修饰在所述基底电极上；电子传递体，为有机分子或高分子电子传递体；壳聚糖凝胶，由壳聚糖溶液制成；以及6-甲氧基双呋喃香豆素氧化酶；其中，由活化后的单壁碳纳米管均匀分散在壳聚糖溶液中形成电子传递体-壳聚糖凝胶混合膜；所述6-甲氧基双呋喃香豆素氧化酶包埋固定在电子传递体-壳聚糖凝胶混合膜上，再组装在聚合物膜修饰的基底电极上，形成用于检测杂色曲霉素的生物传感器。2. 根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于所述的电子传递体是经强酸或强 氧化剂活化处理的单壁碳纳米管。3. 根据权利要求1所述的生物传感器的组装方法，其特征在于，包括以下步骤A、 将邻苯二胺单体通过电化学的方法聚合在基底电极表面，得到聚邻苯二胺聚合物膜 修饰的基底电极；B、 将壳聚糖溶液制成壳聚糖凝胶；C、 将单壁碳纳米管活化处理后，加入到上述的壳聚糖溶液中混匀，即得单壁碳纳米 管-壳聚糖混合液，备用；D、 制备6-甲氧基双呋喃香豆素氧化酶溶液，备用；E、 将6-甲氧基双呋喃香豆素氧化酶溶液与单壁碳纳米管_壳聚糖混合液混匀，滴加在聚邻苯二胺聚合物膜修饰的基底电极表面，4t:组装过夜，即得所述的生物传感器。4. 根据权利要求3所述的生物传感器的组装方法，其特征在于，包括以下步骤a、 聚邻苯二胺修饰基底电极的制备清洗干净的基底电极在使...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘大岭，陈俊华，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]