一种龙血素A酶联免疫检测试剂盒制造技术

本实用新型专利技术提供一种龙血素A酶联免疫检测试剂盒，涉及免疫检测领域。其包含外壳、固定有龙血素A的酶标板、盒内支架。酶标板反应孔内固定有龙血素A与载体蛋白分子偶联物。采用间接竞争酶联免疫法检测样品中龙血素A的浓度。待测样品中的龙血素A浓度与检测吸光度值呈负相关，用标准品浓度及其吸光度拟合标准曲线，样品吸光度与标准曲线比较得出样品中龙血素A的浓度。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本技术涉及免疫检测领域，特别是涉及一种检测龙血素A的试剂盒。
技术介绍
龙血素A(4’ -羟基_2，4，- 二甲氧基二氢查耳酮)是传统药物龙血竭的有效成分之一。龙血竭被誉为“活血圣药”，它是由百合科植物剑叶龙血树(Dranaenacochinachinensis (Lour.) S.C.Chen)的含脂木材经提取得到的树脂,在临床上主要有活血散瘀，定痛止血，敛疮生肌等功效。有研究认为龙血素A有血小板聚集抑制作用、抗真菌等活性。目前市场上龙血竭的质量参差不齐，有的混入其他树脂，传统的鉴定方法主要靠有经验人员的主观判断，现代药品标准中的检测方法采用薄层色谱法、分光光度法等，处理繁琐。所以急需一种能有效便捷地检测龙血竭质量的方法。用龙血竭的主要有效成分龙血素A可作为龙血竭的质量判断标准。目前对龙血素A的检测主要采用高效液相色谱法。酶联免疫检测法具有高通量、快速、灵敏的特点，且广泛用于医学检验，技术成熟，在中药材的品质鉴定方面也有大量的应用。龙血素A的酶联免疫检测方法还未见报道，研制龙血素A的酶联免疫检测试剂盒有重要意义。现代化的检测诊断手段越来越多地应用于科研和临床，现今药物浓度检测产品多是针对西药，我国传统药物现代化研究中迫切需要现代化的灵敏便捷的检测手段和产品。
技术实现思路
本技术提供一种龙血素A酶联免疫检测试剂盒，试剂盒外壳内含有盒内支架和固定有龙血素A的酶标板，固定有龙血素A的酶标板放置在盒内支架上。龙血素A酶联免疫检测试剂盒的盒内支架中有插槽，插槽中放置的试剂瓶分别为样品稀释液瓶、龙血素A多克隆抗体溶液瓶、酶标记抗体溶液瓶、底物液瓶、终止液瓶、浓缩洗涤液瓶、龙血素A标准品瓶。这样设计便于试剂存放、运输及在检测中使用。龙血素A酶联免疫检测试剂盒中的酶标板反应孔内包被固定有龙血素A与载体蛋白分子偶联物。载体蛋白为鸡卵清白蛋白、牛血清白蛋白或血蓝蛋白。龙血素A酶联免疫检测试剂盒可用于检测样品中龙血素A的浓度。本试剂盒采用间接竞争酶联免疫法检测样品中龙血素A的浓度。检测时，向试剂盒中的酶标板孔中加入样品溶液和龙血素A多克隆抗体溶液，反应后洗涤，加入酶标记抗体溶液，反应后再次洗涤，加入底物液显色，用终止液终止反应后用酶标仪测定吸光度。待测样品中的龙血素A浓度与吸光度值呈负相关，用用四参数Logistic方程拟合标准曲线，样品吸光度与标准曲线比较得出龙血素A的浓度。龙血素A酶联免疫检测试剂盒检测的样品是含有龙血素A的溶液或是血液样品。本试剂盒用于检测龙血竭样品，通过比较待测龙血竭与合格龙血竭中龙血素A的含量来判断龙血竭质量。附图说明图1.本技术龙血素A酶联免疫检测试剂盒内部俯视示意图其中1-试剂盒外壳，2-盒内支架，3-固定有龙血素A的酶标板，4 10为支架上的插槽，插槽中各试剂瓶分别盛装液体为:样品稀释液、龙血素A多克隆抗体溶液、酶标记抗体溶液、底物液、终止液、浓缩洗涤液、龙血素A标准品。具体实施方式如图1所示，本技术提供一种龙血素A酶联免疫检测试剂盒，包含外壳1、插有试剂瓶的支架2、固定有龙血素A的酶标板3。使用支架放置各试剂瓶，便于试剂盒的存放、运输和使用。其中试剂瓶盛装的液体分别为:样品稀释液、龙血素A多克隆抗体溶液、酶标记抗体溶液、底物液、终止液、浓缩洗涤液、龙血素A标准品。这些试剂在检测中使用。龙血素A酶联免疫检测试剂盒中的酶标板反应孔内包被有龙血素A与载体蛋白分子偶联物。实施例1.试剂盒各组分的制备和试剂盒成品的组装1.1样品稀释液含0.15M NaCl 和 0.005% 吐温-20°C 的 0.1M 的磷酸盐缓冲液，PH7.4。1.2龙血素A包被原制备取龙血素A9.4mg，溶于Iml 二甲亚砜，并加入适量的Κ0Η，再加入30mg溴乙酸，在室温反应4h，用G5砂芯漏斗抽滤，弃滤液，用乙醇洗下沉淀物，真空干燥得到半抗原。取2.48mg半抗原溶于0.08ml的N, N- 二甲基甲酰胺(DMF),然后将1.08mg的N, N- 二环己基碳二亚胺(DCC)和0.6mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)分别溶于0.03ml的DMF中，并在搅拌条件下依次逐滴滴加到半抗原溶液中，于室温下密闭搅拌4h，4°C冰箱过夜。次日4000r/min离心IOmin取上清——活性酯液待用。称取鸡卵清白蛋白OVAlOmg，溶于2mL0.05MPH8.0PBS,取活性酯液，冰浴下逐滴滴加到BSA溶液中，室温反应2h，于4°C冰箱缓慢搅拌反应过夜。TLC跟踪观察反应。将反应液装入透析袋，于4°C下，pH7.4，0.0lM的PBS中透析3天，紫外扫描透析外液中无半抗原紫外吸收为止或紫外下观察显色。取出透析袋内溶液，分装，_20°C保存，得龙血素A-OVA偶联物，即龙血素A包被原。1.3龙血素A包被酶标板制备用0.05M碳酸盐缓冲液(PH9.6)将龙血素A包被原稀释到4 μ g/ml，加入酶标板孔中，100 μ L/孔，2-8°C冷藏过夜，倒掉包被液，用洗涤液清洗3次。每孔加入封闭液(含1%脱脂奶粉的PBS溶液)120 μ L，37°C孵育2小时，倒掉封闭液，拍干，于30°C干燥3_4小时，铝箔袋真空包装。1.4龙血素A多克隆抗体溶液制备使用1.2中方法把OVA替换为BSA合成龙血素A-BSA偶联物作为免疫原，取6_7周龄的Balb/C小白鼠进行免疫。基础免疫使用等量弗氏完全佐剂与龙血素A-BSA偶联物乳化，每只背部皮下注射龙血素A-BSA偶联物0.025mg,加强免疫采用弗氏不完全佐剂乳化免疫原，每隔2周进行加强免疫，三免后第10天小鼠眼眶采血，分离出抗血清，其中含有龙血素A多克隆抗体，用样品稀释液稀释1000倍使用。1.5酶标记抗体溶液使用天津三箭生物技术有限公司生产的HRP标记羊抗小鼠IgG，用含0.1 % OVA的0.1M的磷酸盐缓冲液(PH = 7.4)稀释4000倍。1.6终止液为2mol/L的硫酸溶液。1.7浓缩洗涤液含0.5%吐温-20的0.2M的磷酸盐缓冲液，PH = 7.4。1.8龙血素A标准品用样品稀释液稀释的龙血素A溶液。1.9底物液购自郑州博威嘉生物科技有限公司。1.10试剂盒组装取固定有龙血素A的酶标板、样品稀释液、龙血素A多克隆抗体溶液、酶标记抗体溶液、底物液、终止液、浓缩洗涤液、龙血素A标准品各一个插在盒内支架插槽中，包上外壳，即组成一个龙血素A酶联免疫检测试剂盒。实施例2检测药品中龙血素A含量用样品稀释液稀释样品，向试剂盒中的酶标板孔中加入样品溶液50 μ L/孔和龙血素A多克隆抗体溶液50 μ L/孔，37°C反应30min后洗涤，加入酶标记抗体溶液100 μ L/孔，反应后再次洗涤，加入底物液100 μ L/孔避光显色lOmin，加终止液100 μ L/孔终止反应后用酶标仪测定吸光度(双波长测定用0D450nm减去0D630nm作为吸光度)。每次反应用样品稀释液将标准品稀释成10 μ g/ml、I μ g/ml、0.1 μ g/ml、0.01 μ g/ml、0 μ g/ml的系列标准品加入酶标板与样品同时反应。待测样品中的龙血素A浓度与吸光度值呈负相关，用标准品吸光度和标准品浓度用四参数Logistic方程拟合标准曲线，代入待测样品吸光度值即可求出龙血素A的浓度。实本文档来自技高网...

【技术保护点】
龙血素A酶联免疫检测试剂盒，其特征是：试剂盒外壳内含有盒内支架和固定有龙血素A的酶标板，固定有龙血素A的酶标板放置在盒内支架上。

【技术特征摘要】
1.龙血素A酶联免疫检测试剂盒，其特征是:试剂盒外壳内含有盒内支架和固定有龙血素A的酶标板,固定有龙血素A的酶标板放置在盒内支架上。2.根据权利要求1所述的龙血素A酶联免疫检...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘向明，沈洲，陈素，雷丽云，李羽欣，龙蓉，米雪，
申请(专利权)人：中南民族大学，
类型：实用新型
国别省市：