鉴定大豆Lox3特异性引物及其方法技术

本发明专利技术公开了一种鉴定大豆Lox3缺失体的特异性引物，包括以下引物对：Lox3F：TAACCAGCGTTGGGGGAA?；Lox3R：CATTTATAGACGTGCGTGCA。本发明专利技术还公开了鉴定大豆Lox3缺失体的方法：以待测缺失体的大豆基因为DNA模板，将上述引物对上述DNA模板进行PCR扩增；若述PCR扩增产物中有474bp条带，则上述待测大豆基因含有Lox3，若无474bp条带，则上述待测大豆基因缺失Lox3。本发明专利技术的有益效果在于，不但节约时间和费用，而且鉴定结果准确可靠，可显著提高对Lox3缺失体材料的筛选效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及鉴定大豆Lox3缺失体的特异性引物及其方法，主要应用于分子标记的

技术介绍
大豆脂肪氧化酶(Lox)是一种含非血红素铁、水溶性球蛋白质。Lox通过催化不饱和脂肪酸中顺，顺1，4-戊二烯结构，形成过氧化氢衍生物，再继续转化成低级的醛和酮等有害物质，从而产生豆腥味和其他挥发性物质，阻碍了大豆在食品中的广泛应用。Lox催化产生的过氧化氢物，能直接与食品中的营养成分结合，降低食品的食用品质和营养价值。高温处理可减轻大豆豆醒味，但会导致蛋白质变性，使蛋白质加工性能和利用率降低。此夕卜，通过微波照射、改变介质pH、有机溶剂萃取和醛水解酶水解等方法，也可以降低或消除大豆豆腥味。上述方法都会不同程度增加大豆产品成本，且常常会导致大豆蛋白质溶解度下降，降低食品营养价值。因此，通过遗传育种手段选育大豆Lox缺失体材料，以降低或消除Lox活性的影响具有重要意义。王若兰等(2008)研究认为，大豆Lox缺失体样品在储藏期间的品质变化比正常品种缓慢，Lox缺失可在一定程度上提高大豆储藏品质的稳定性。王金龙等(2000)研究认为，大豆Lox缺失对蛋白质、脂肪及脂肪酸含量没有影响，但可能引起种子中脯氨酸含量降低，而对其它氨基酸无影响。脯氨酸不属于人体必需氨基酸，故Lox缺失不会引起大豆营养品质降低。Julian等(2010)采用探针技术分别鉴定Lox2和Lox3,但该技术存在技术复杂、费用较闻等问题。通过分子标记技术筛选大S.Lox缺失体,可以加快无腥大豆品种选育进程，进而从根本上改善大豆产品豆腥味，提高大豆的储藏品质。对目前已有的LOX缺失体中LOX基因进行测序分析，表明Loxl缺失体在其编码基因的第8个外显子内缺失I个74bp的片段，导致Loxl蛋白翻译过早终止；Lox3缺失体在其编码基因的第I个外显子内缺失I个单核苷酸“G”，从而导致移码突变。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供鉴定大豆Lox3缺失体的特异性引物及其方法。本专利技术是通过以下技术方案来实现的。一种鉴定大豆Lox3缺失体的特异性引物，包括以下两组引物对:Lox3F:TAACCAGCGTTGGGGGAA ；Lox3R:CATTTATAGACGTGCGTGCA。一种上述的特异性引物鉴定大豆Lox3缺失体的方法，包括以下步骤:(I)以待测缺失体的大豆基因为DNA模板，将上述两组引物对上述DNA模板进行PCR扩增；(2)若述PCR扩增产物中有474bp条带，则上述待测大豆基因含有Lox3，若无474bp条带,则上述待测大豆基因缺失Lox3。进一步地，上述Lox3缺失体的大豆为五星I号、五星4号、鉴31中的任意一种。本专利技术的有益效果:本专利技术提供的特异性引物及其鉴定技术，不但节约时间和费用，而且鉴定结果准确可靠，可显著提高对Lox3缺失体材料的筛选效率。附图说明图1为实施案例I琼脂糖凝胶电泳的示意图。具体实施例方式下面根据附图和实施例对本专利技术作进一步详细说明。在下述的实施案例I中，一共选取七种大豆品种进行鉴定,这七种大豆品种均由河北省农林科学院提供的常用品种。1、五星I号审定编号:冀审豆2001002号品种来源:河北省农林科学院粮油作物研究所1997年育成，亲本组合为冀豆9/Century02、五星2号审定编号:国审豆2004005选育单位:河北省 农林科学院粮油作物研究所品种来源:冀豆9号XCentury3、五星3号选育单位:河北省农林科学院粮油作物研究所品种来源:冀豆9号XCentury4、五星4号审定(登记)编号:冀审豆2009005号选育单位:河北省农林科学院粮油作物研究所品种来源:冀豆12 X Suzuyutaka5、鉴 31由河北省农林科学院提供，为推广品种6、中黄 13品种审定编号:国审豆2001008品种来源:豫豆8号/中90052 — 76，为推广品种选育单位:中国农业科学院作物育种栽培研究所实施案例1:1、DNA 提取:(1)0.1g 大豆粉加入 0.7mLSDS 提取液(0.1M Tris-HCl (ΡΗ=8.5)，0.1MNaCl, 0.05Μ EDTA(ΡΗ=8.0), 2% SDS)在 65°C恒温下裂解 45min，其间多次震荡。(2)在 4°C 12000rpm 条件下，离心 lOmin。(3)取上清液加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)上下颠倒旋转至两相不很快分层。(4)在 4°C 12000rpm 条件下，离心 lOmin。(5)取上清液加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)上下颠倒旋转数次。(6)在 4°C 12000rpm 条件下，离心 lOmin。(7)取上清液加入等体积的异丙醇于_20°C冰箱静置30min。(8)在 4°C 12000rpm 条件下，离心 lOmin。(9)用70%的乙醇洗涤两次。(10)在 4°C 12000rpm 条件下，离心 lOmin。(11)沉淀自然风干。2、引物 LoxlF:ATCTTAGCGTGCTTCACCCA LOXlR:CATCAGCGGCATAAGGATAG。引物均有Primer Premier 5软件设计。3、反应体系:2uL 2.5mM dNTP，0.5uL IOuM 上下游引物，2uL 10*Ex TapBuffer, IU TaKaRa Tap, 150ng DNA 模板，用双蒸馏水补齐到 20uL。4,PCR反应程序:变性:94°C 5min，94°C 45s，退火:65°C每个循环降0.4 °C 20个循环 50s,延伸:72°C 45s，变性-MV 45s，退火:61.5°C 50sl4 循环，延伸:72 V 45s,延伸:72 0C 8min。5、琼脂糖凝胶电泳:1.5%琼脂糖凝胶，缓冲体系为I X TAE溶液，在IOOV恒压下，电泳50min，溴化乙锭(EB)染色，凝胶成像系统扫描并保存。若述PCR扩增产物中有474bp条带，则上述待测大豆基因含有Lox3，若无474bp条带，则上述待测大豆基因缺失Lox3。图1为实施案例I琼脂糖凝胶电泳的示意图，参照图1，其中，M:marker 1:五星I号(缺失Lox2、3)2:五星2号(缺失Lox2)3:五星3号(缺失Lox2)4:五星4号(缺失Loxl、2、3)5:鉴 31 (缺失 Loxl、2、3) 6:中黄 13图1清楚地说明了这七种不同品种的五星I号、五星4号、鉴31中为Loxl缺失体。具体实验结果参照图1所示的琼脂糖凝胶电泳的示意图。本专利技术，提供的特异性引物及其鉴定技术，不但节约时间和费用，而且鉴定结果准确可靠，可显著提高对Loxl缺失体材料的筛选效率。上述实施例只为说明本专利技术的技 术构思及特点，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本
技术实现思路
并加以实施，并不能以此限制本专利技术的保护范围。凡根据本专利技术精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本专利技术的保护范围内。 <110>安徽农业大学 <120>鉴定大豆Lox3缺失体的特异性引物及其铪亡方决 <160 <170〉PatentIii Version 2,1 <210> I <21 卜 38 <2i2>DNA <213> 人显(Glyc本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定大豆Lox3缺失体的特异性引物，其特征在于，包括以下引物对：Lox3F：TAACCAGCGTTGGGGGAA?；Lox3R：CATTTATAGACGTGCGTGCA。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张文明，胡明建，王晓波，姚大年，郑文寅，司红起，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：