本发明专利技术涉及一种鉴定外来入侵物种互花米草种群的DNA分子标记方法，本方法根据高通量转录组测序筛选得到目标基因，通过PCR反应、PCR产物测序得到多个单核苷酸多态性（SNP）位点。再由所有有效的单核苷酸多态性位点组成单倍体型用于分子标记以达到遗传分型。本发明专利技术在一次实验中，即可得到丰富的多态性信息。单核苷酸多态性标记遗传稳定，可用于不同来源的样本，适宜高通量自动化分析。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生态工程
，涉及一种鉴定外来入侵物种互花米草种群的DNA分子标记方法。
技术介绍
外来生物入侵已成为当今环境保护中最为迫切的问题之一，其对世界各国的经济、生态、社会安全以及国际贸易都有着十分重要的影响。美国每年直接或间接用于入侵物种管理的费用就高达1370亿美元。中国同样也已成为全球遭受外来物种入侵危害最严重的国家之一，已发现外来入侵物种488种，其中50余种位列世界自然保护联盟公布的全球100种最具威胁外来物种，每年造成的直接经济损失达1200亿元，治理投入更是难以估算。近年来入侵我国的外来生物更是呈现出传入数量增多、传入频率加快、蔓延范围扩大、发生危害加剧、经济损失加重等趋势。因此，生物入侵问题越来越受到世人的关注，包括其成因、危害及控制技术等诸多方面。但目前，大部分的研究主要集中在竞争性排斥、生态位替代、生物学特性、化感、捕食、寄生等生态过程，缺乏对其种群动态、快速适应与进化模式、快速入侵与扩张动力等入侵机制方面的理解。DNA分子标记(DNA molecular markers)本质上是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，也即基因型在DNA水平上的表现形式。这种DNA片段是基因组DNA经限制性内切酶切割，或分子杂交后在电泳凝胶上检测得到的。目前DNA分子标记技术主要包括三类:(I)以分子杂交为基础的，如RFLP、VNTR等；(2)以PCR技术为基础的，如RAPD、AFLP, DAF、STS、SSR、SCAR等；(3)利用DNA芯片、直接测序等方法检测单核苷酸多态性(SNP)。单核苷酸多态性是指同一位点的不同等位基因之间仅有个别核苷酸的差异或只有小的插入、缺失等。从分子水平上对单个核苷酸的差异进行检测，单核苷酸多态性标记可帮助区分个体间遗传物质的差异。随着分子标记技术的成熟及其在分子生态学中的广泛应用，外来物种入侵机理日益成为国际上研究的重点。大量的研究表明外来入侵种能在如此短的时间内迅速地做出适应性的进化，可能与其自身的遗传结构密切相关。因而，在外来入侵物种上，亟需一种能够有效揭示外来入侵物种遗传本质的方法。互花米草(Spartina alternif1ra)是一种原产北美大西洋沿岸的多年生草本植物。因其促淤造陆和消浪护堤作用显著而被许多国家引种。1979年，南京大学从美国东南部的北卡罗莱纳、乔治亚和佛罗里达引种了 3种不同生态型互花米草至福建罗源湾，随后扩大分布至我国海岸潮间带辽宁丹东以南的广大区域，并取得了一定的生态和经济效益。但作为外来物种，其强大的繁殖能力和高大密集的种群特征，对我国沿海滩涂地区的生态系统、生物多样性和水产养殖产生了较大的负面影响，2003年被环保总局列入我国第一批16种外来入侵物种名单。因此，对其入侵过程和扩张机制的研究已刻不容缓。本专利技术以列入中国首批外来入侵物种的互花米草为对象，在整个基因组内批量寻找多态性位点，全面评估外来入侵物种的多样性，并揭示其遗传本质和入侵机制，为进一步研究和控制外来入侵物种提供有力的技术支持。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种鉴定外来入侵物种互花米草的分子标记方法，能够在基因组序列信息较少的情况下，获得大量的核苷酸多态性标记，发现引入的不同种群之间存在的遗传变异，为揭示其遗传本质和入侵机制，进一步研究和控制外来入侵物种提供有力的技术支持。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的:一种鉴定外来入侵物种互花米草种群的DNA分子标记方法，步骤如下:1)种群调查及取样；2) DNA 提取；3)测序;4)筛选目标基因R52;5)根据目标基因R52设计引物，正向引物如序列表中SEQ ID NO:1所示；反向引物如序列表中SEQ ID NO:2所示；6) PCR 扩增；7)测序；8)序列拼接、比对，鉴定记录单核苷酸多态性位点。进一步地，所述目标基因R52是通过高通量转录组测序后筛选得到。进一步地，所述PCR扩增的反应条件为:94°C预变性3min，94°C 30s、54°C 30s、72°C 1.5min,37 个循环，72°C延伸 10min.进一步地，所述目标基因R52在互花米草种群中有8个SNP位点，目标基因R52基因片段序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，其中8个SNP位点分别位于118、212、251、305、578、869、934、962。进一步地,高通量转录组测序的方法:提取样本总RNA,用Oligo (dT)的磁珠富集分离mRNA,合成双链cDNA,构建转录组测序文库,插入片段长度约为500bp,在illuminaHiSeq2000测序仪上进行高通量测序，使用Trinity软件对测序片段进行拼接，从而得到基因序列。本专利技术的有益效果:包括互花米草在内的许多外来入侵物种为非模式植物，基因组庞大，很多物种缺少全基因组数据，在进行传统的各种传统分子标记分析时，如RAPD、SSR、AFLP，发现实验结果的一致性较差，假阳性率偏高。而且，传统分子标记一次实验只能找到少量多态性位点信息，如果需要高精度的分辨率，需要多次实验。本专利技术在一次实验中，即可得到8个单核苷酸多态性SNP位点，提供丰富的多态性信息。同时，本专利技术的实验条件简单，成功率高，可重复性好。在实施过程中，实验成功率在98%以上，实验结果可重复性更达到100%。本专利技术采用的8个SNP位点，单倍体基因型理论上可以达到2的8次方，即256，能够提供非常丰富的多态性信息，使结果更加准确。SNP标记遗传稳定，可用于不同来源的样本，适宜高通量自动化分析。具体实施方式:下面结合具体样本对本专利技术做进一步的详细说明，所述是对本专利技术的解释而不是限定。1.种群调查及取样最早引入外来入侵物种的地区，福建罗源湾的互花米草是我国的最原始种群，将其作为采样点。上海崇明岛距离分析点较近，采集后样品保存度高，将其作为采样点。选取生长良好、无虫害的叶片，采下后立刻放入事先准备好的装有约半袋硅胶的自封袋里，混匀使叶片与硅胶充分混合，以便快速脱水。带回实验室后根据实际情况更换已经变色的硅胶，干燥之后待提取DNA用。每一采样点随机取样30株左右，个体间的间距不小于50米，以尽可能避免重复采集同一克隆，记录每一样本的编号、生境、地理参数(经纬度)、样品高度，样品直径等详细信息。2.DNA 提取使用BioFlux公司的Biospin植物基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，具体步骤稍作调整:(I)称取0.07-0.1g干叶，用剪刀剪碎；用液氮冷冻研钵、研棒，将材料倒入盛有液氮的研钵中，用力磨成粉末，在研磨过程中注意不要让材料反复冻融。(2)将研磨好的粉末用勺小心地转移至预先加入450uL LP Buffer的2.0ml离心管中，混合均匀。(3)65°C金属浴中温浴30-60分钟(温浴过程中间隔振荡2_3次)，然后移出。(4)加入150uL DA Buffer，混合均匀后于冰浴中放置5分钟。(5)于13，OO Orpm离心10分钟，再将上清液转移至Shredder spin column中,13, OOOrpm离心I分钟。(6)将滤液转移到一个新的1.5ml离心管中。(7)加入滤液体积1.5倍的P Binding Buffer,轻柔的混合均匀，管中出现絮状沉淀，13, OOOrpm离心本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鉴定外来入侵物种互花米草种群的DNA分子标记方法，其特征在于，步骤如下：1)种群调查及取样；2)DNA提取；3)测序；4)筛选种群的目标基因R52；5)根据目标基因R52设计引物，正向引物如序列表中SEQ?ID?NO：1所示；反向引物如序列表中SEQ?ID?NO：2所示；6)PCR扩增；7)测序；8)序列拼接、比对，鉴定记录单核苷酸多态性位点。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈建群，许颖，王强，丁静，吴娟子，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：
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