本发明专利技术公开了一种检测黄牛生长性状的基因诊断试剂盒，是一种PAX6基因检测黄牛生长性状的方法，该方法以包含PAX6基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛PAX6基因；通过DNA测序和PCR-SSCP技术进行基因多态性的检测与快速分型，该方法是一种在DNA水平上筛查和检测与黄牛生长性状密切相关的分子遗传标记，故本发明专利技术提供的检测方法可用于黄牛生长性状的分子标记辅助选择，进而快速建立遗传资源优良的黄牛种群。本发明专利技术检测方法简单、成本低，检测结果直接、可靠，适用于对黄牛PAX6基因第17056位突变的大规模的筛查和诊断。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及基因单核苷酸多态性的检测，特别涉及一种PAX6基因检测牛生长性状的方法及其诊断试剂盒。
技术介绍
遗传标记指可追踪染色体、染色体某一节段、某个位点在家系中传递的任何一种遗传特性。它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性，因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。遗传标记大致经历了形态标记、细胞标记、生化标记和分子标记四个发展阶段。1974年,Grodzicker等首次提出用限制性片段长度多态性(restrictionfragment length polymorphism, RFLP)作为遗传标记,开创了直接用DNA作为遗传标记的先河，从而揭开了分子标记研究的序幕。经过数十年的发展，尤其是1985年Mullis等专利技术了 PCR技术以后，分子标记研究呈现出“百家争鸣”的景象。分子标记之所以能反映DNA水平的遗传变异情况主要是基于被研究的DNA分子由于缺失、插入、易位、倒位、重排或存在长短与重排不一的重复机制而产生多态性。经过大量的研究发现，DNA分子标记有许多特点，如直接以DNA的形式表现；某些标记表现共显性；标记数量多；表现为中性；多态性高等。如今，分子标记在生命科学研究领域中已经被广泛应用，在遗传标记中占主导地位。单核苷酸多态性(sinTle nucleotide polymorphism, SNP)是由美国麻省理工学院的人类基因组研究中心的学者Lander (1996)提出的一类遗传标记系统，就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/T)的变化而引起的多态性。它的变异形式有:颠换、转换、插入和缺失等，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起。具有转换型的碱基变异的SNPs约占2/3。在任何已知或未知的基因内或附近都可能找到数量不等的SNPs，基因编码区内的SNPs (cSNPs)比较少，因为在外显子内的变异率仅占周围序列的1/5，但它在遗传病和育种的研究中却具重要意义 ，因此倍受关注。标记辅助选择就是将现代生物技术与常规选择方法相结合，通过对遗传标记的选择来间接选择控制某性状的数量性状位点(QTL)，使之能够同时利用标记位点信息和数量性状的表型信息，更准确估计动物个体的育种值，提高选择效率，加快育种进展。标记辅助选择主要经历了三个阶段:第一阶段是家畜各性状间的遗传分析；第二阶段是蛋白质(酶)标记对数量性状的标记阶段；第三个阶段是分子遗传标记阶段。随着分子标记技术日渐成熟与丰富，使覆盖整个基因组的标记成为可能，通过与QTL间的连锁分析，实现分子标记辅助选择的目标。SNP作为新的遗传标记已广泛应用于基因定位、克隆、遗传育种及多样性的研究。分子育种，即分子标记辅助选择(molecularmark-assist selection, MAS),该技术是借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良，它是利用现代分子生物学和传统遗传育种相结合的方法，进行新品种选育。在畜禽育种中，人们期望，通过对生长性状密切相关，并且与数量性状紧密连锁的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。近年来，人们发展了许多用于探寻分子遗传标记的方法，最常见的有单链构象多态技术(SSCP) ,PCR-RFLP和直接测序技术等，SSCP它可以发现靶DNA片段中未知位置的碱基突变。Takao经实验证明小于300bp的DNA片段中的单碱基突变，90%可被SSCP发现，他认为现在知道的所有单碱基改变绝大多数可用该方法检测出来。另外，SSCP方法可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同迁移率的突变单链DNA分离，并且还可以进一步提纯。用这种方法可以最终从DNA序列水平上鉴别突变DNA片段。该方法简便、快速、灵敏，不需要特殊的仪器。牛的PAX6基因(paired box gene6)位于15号染色体上,长28.24kb,包含13个外显子和12个内含子，该基因对调控垂体前叶GH、ACTH、FSH、LH等激素的分泌有着至关重要的作用，而GH等激素的分泌直接关系到动物的生长性状。当该基因发生变异时，导致PAX蛋白异常，丧失了转录因子的调节作用，从而严重影响生物的生长发育性状。因此，对PAX6基因遗传变异及其与生长发育、经济性状关系进行研究，具有重要理论和实践意义。目前，在国内有关家畜上PAX6基因研究的资料报道很少，作为大家畜的黄牛在国内还未见该基因多态性的报道。因此本研究利用PCR-SSCP技术首次对中国黄牛PAX6基因进行遗传变异分析，研究表明PAX6基因不同基因型对6，12和24月龄的南阳牛体重、体高、体斜长、胸围、坐骨端宽和平均日增重有显著影响(P〈0.05)。本实验室的研究结果表明，PAX6基因可以作为南阳牛生长性状有效选择标记。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题在于提供一种检测黄牛PAX6基因单核苷酸多态性的方法，寻找与经济性状关联的SNP作为分子标记，加快具有优质经济性状黄牛种群的建立。本专利技术通 过以下技术方案来实现:一种检测黄牛PAX6基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，以包含PAX6基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛PAX6基因；琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物片段大小；用变性剂处理PCR扩增产物之后，再对变性后的扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定黄牛PAX6基因第17056位的单核苷酸多态性；所述的引物对P为:上游引物:5’-ATCTTGATTTGATTTGCAGGT-3’ ；下游引物:5’-CAAACACCCATCCTCAA-3’ ；所述的PCR扩增反应程序为:95°C预变性 4min ;94°C变性 30s，59.1°C退火 30s，72°C延伸 30s，34 个循环；72°C延伸IOrnin0琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物片段大小，所用的琼脂糖凝胶的质量浓度为1.5%。所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳质量浓度为10%。所述根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛PAX6基因第17056位的单核苷酸多态性为:TT基因型表现为17056位为核苷酸T纯合；TC基因型表现为17056位为核苷酸T/C杂合；CC基因型表现为17056位为脱氧核苷酸C纯合；其中，单核苷酸多态性CC基因型为突变纯合基因型。与现有技术相比，本专利技术具有以下独特的技术效果:本专利技术根据已公布牛PAX6 基因(GenBank Accession N0.NW001493316.1)的序列设计引物，分别以3个黄牛品种的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，将测序后得到的黄牛PAX6基因的部分序列与NCBI公布的序列进行比较，发现在PAX6基因的第17056位存在SNP多态性。针对上述第17056位的SNP多态性，本专利技术还公开了其筛查和检测方法，进行PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物片段大小，用变性剂处理扩增产物后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，能够简单、快速、低成本、精确地检测其单核苷酸的多态性。本专利技术提供的检测方法为PAX6基因的SNP与黄牛部分生长性状进行关联分析，研究表明基因型对南阳牛群体的体重等性状有显著影响(p〈0.05)。以上研究表明，PAX6基因结果表明该位本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测黄牛PAX6基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，（1）以包含PAX6基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛PAX6基因，所述的引物对P为：上游引物：5’?ATCTTGATTTGATTTGCAGGT?3’；下游引物：5’?CAAACACCCATCCTCAA?3’；（2）用琼脂糖凝胶电泳检测步骤(1)中PCR扩增产物片段大小；（3）用变性剂处理步骤(1)中PCR扩增产物之后，再对变性后的扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定黄牛PAX6基因第17056位的单核苷酸多态性。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈宏，黄永震，魏天宝，蓝贤勇，雷初朝，胡沈荣，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：
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