本发明专利技术提供一种结核分枝杆菌重组蛋白质及其制备方法，涉及基因工程技术和诊断试剂、疫苗研制领域。本发明专利技术涉及一种可用于结核分枝杆菌感染临床诊断的结核分枝杆菌融合蛋白，编码该蛋白的核苷酸序列，包括该核苷酸序列的质粒和原核宿主细胞，本发明专利技术还包括制备该蛋白的方法的及其应用。该重组蛋白质具有高特异性、强免疫原性蛋白质序列，可提高检测试剂的敏感性和特异性，且该重组蛋白质采取了多抗原决定簇串联的重组蛋白质技术，可以简化提纯过程，提高工作效率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程技术和诊断试剂、疫苗研制领域，特别是涉及。
技术介绍
结核病(Tuberculosis, TB)是人类最古老的传染病之一,至今依然是单一感染因素引起死亡人数最多的疾病，严重威胁着人类健康。近年来随着艾滋病的蔓延及全球人口流动速度和数量的急速增长，结核病的发病率呈上升趋势，尤其是发展中国家贫困、落后、饥饿、人口拥挤、医疗卫生条件差等现象更使结核病难以得到控制。据WHO统计，全世界现有17. 22亿人感染结核病菌，每年有900万新结核病人，其中约300万人死于结核病。我国是世界上22个结核病高负担国家之一，目前全国约有5. 5亿人感染过结核菌，感染率达 到44. 5%，高于全球1/3的感染率水平，肺结核病人600多万，其中有严重传染性的病人150万，每年死于结核病的达25万人。据研究，受结核菌感染的人群中，10%的人会发展为结核病。结核病还是一种人畜共患传染病。因此，结核病的预防、早期诊断和及时治疗仍是我国乃至世界高度关注的课题。结核病是由结核杆菌引起的，主要通过呼吸道传播，通常表现为肺部感染，而当人体抵抗力下降时，结核杆菌就迅速生长繁殖而引发肺结核，若病人的抵抗力继续下降或得不到及时治疗，结核杆菌就会通过淋巴、血液传播到身体各器官，并在该处引起结核病。常见的有肾结核、结脑、肠结核、淋巴结核等肺外结核。但是，由于结核病是一种慢性传染病，有些感染者历程症状不明显，因此常不引起患者注意而延误病情。故对结核病的早期诊断对有效控制结核病，降低该病的发生率及死亡率有着重大的临床意义。目前常用的结核病诊断方法有胸部X光透视和主要依靠患者痰液、胸水、支气管肺泡液的显微镜直接涂片检查(AFP)以及培养法。X光常用作肺结核初步诊断，但特异性差，同时对感染有艾滋病病毒(HIV)的结核病人及肺外结核病人不适用。AFB涂片法灵敏度差(仅为2(T30% )，用固体培养基培养结核菌，虽然可以显著改善检测结果，但结核菌生长缓慢，一般得6 - 8周才能出检验报告，况且AFB涂片和培养法只能在检测方法只能在体液中存在细菌时方能检出，而对于不排菌的结核患者就检测不出，故认为上述检测方法已经不能适应临床诊断治疗及传染病控制的要求。为此，人们就企图利用血清学方法以快速诊断结核病。近年来，随着结核分枝杆菌分子生物学与蛋白组学的研究不断发展，结核病的免疫学诊断亦有较大进展。目前已经发现、纯化和重组了多种结核分枝杆菌特异性的菌体和分泌蛋白质抗原。由于结核分支杆菌抗原的复杂性，在宿主体内表达的数量、种类或时机可能随病人的个体免疫背景和病程而异，表现出不同的抗体谱，检测时有的抗原不表达，未检测出相应的抗体，有的抗体含量高，有的则低。因此，单一抗原检测，往往检测的灵敏度并不近如人意。目前很多研究者试图用鸡尾酒式混合抗原来提高结核病感染的诊断效果，结果表明用多种特异性抗原可以在不影响特异性的情况下获得比单一抗原更高的敏感性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种结核分枝杆菌重组蛋白，本专利技术的另一目的是提供该结核分枝杆菌重组蛋白在制备检测试剂盒中的应用。为了实现上述目的，本专利技术提供了一种编码结核蛋白的重组核酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。同时提供了由该重组DNA序列编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO. 2所示。本专利技术还提供了一种结核分枝杆菌蛋白的的表达载体pET-28a—ricR-rpoB-GyrB,它是将SEQ ID NO. I所示所述的核苷酸序列插入到质粒pET-28a上得到的重组质粒,其质粒图谱如附图2所示。将表达载体pET-28a—ricR-rpoB-GyrB导入大肠杆菌中,得到表达结核 蛋白的工程菌株。本专利技术利用SEQ ID NO. I所示核苷酸序列通过基因工程方法制备结核蛋白可以通过如下步骤实现I)获得具有SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列；2)将该核苷酸序列导入质粒，优选pET_28a质粒；3)将该质粒导入原核宿主细胞，优选大肠杆菌宿主细胞，更优选BL21 (DE3)菌株中； 4)在有利于所述核苷酸序列表达的条件下培养所述宿主细胞； 5)回收、纯化及复性所表达的重组蛋白。本专利技术还提供包含本专利技术结核蛋白的组合物以及试剂盒。所述的组合物可作为检测结核感染的试剂。所述的组合物可作为检测结核分枝杆菌感染的试剂盒。本专利技术提供的结核蛋白抗原具有高特异性、强免疫原性和尽量完整的抗原决定簇，因此，本领域技术人员可以想到，本专利技术的结核蛋白可以用来制备结核疫苗，如亚单位疫苗等，同样，本专利技术所公开的如SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列也可用来制备DNA疫苗。因此本专利技术还涉及包含本专利技术结核蛋白或核酸的结核的疫苗。以下将更详细的描述本专利技术的技术方案本专利技术公开了一种如SEQ ID NO: I所示的编码结核蛋白的重组核酸，利用该核苷酸序列制备结核分枝杆菌蛋白的方法，由该方法制备的包含SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的结核分枝杆菌蛋白，以及包含该蛋白的组合物和试剂盒，同时还公开了它们在检测结核分枝杆菌感染的应用。SEQ ID N0:1所示核苷酸序列可以通过本领域常规的方法制备，选择其强 抗原表位 ricR 蛋白(GenBank:⑶726749. I)、rpoB (GenBank:GQ395623. I)和 GyrB(GenBank:AJ564417. I)的DNA序列为模板，设计扩增引物。其中Fl和Rl用于扩增ricR基因的片段，F2和R2用于扩增rpoB基因的片段，F3和R3用于扩增GyrB基因的片段；引物Fl和R3分别带有NdeI和XhoI的酶切位点，引物F2和Rl顺序互补，并共同对应于rpoB基因片段的5’末端序列，引物F3和R2顺序互补，并共同对应于GyrB基因片段的5’末端序列；序列如下ricR扩增引物FlATCGCATATG ATGACAGCAGCACACGGCTACACGCAGCA53. 85% Tm=66. 34RlAATCGCGCGCCTGGTTCGTTCCGGTGGTGGTGGTTGTTCTCGA60. 47% Tm=67. 79rpoB扩增引物F2 GGTGGTGGTGGTTGTTCTCGACCGCGCTT62. 07% Tm=61. 06R2 AGTCACCACCACCACCTCGCGGTTGTTCTGGATCAAA54. 05%, Tm=65. 51 GyrB扩增引物F3 GGTGGTGGTGGTGACTCGGCCGGCGGTTCTGCAAAAA62. 16% Tm=65. 54R3 ATCGCTCGAG GTTCTTTAGCACCCGGTCGAT53. 13% Tm=62. 97本专利技术对上述核苷酸序列的核酸分子采用适当载体和宿主细胞表达时可以大大提高表达产率。本专利技术的一个实施方案涉及应用如SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列制备编码结核蛋白的方法。根据常规方法，可将含如SEQ ID NO: I所示核苷酸序列的核酸分子连接到一个表达载体中，然后通过常规方法转化细胞。通常，优选原核生物用于DNA序列的起始克隆和用于本专利技术的载体构建。例如，大肠杆菌等肠科杆菌。编码本专利技术蛋白的核酸与pET_28a形成的杂合质粒具有高度的稳定性，有利于本专利技术的蛋白的表达。在本专利技术的一个实施方案中，如本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种编码结核分枝杆菌蛋白的重组核酸，其序列如SEQ？ID？NO.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：董梅，孙彬，吴纯，杨采娥，雷红，孟祥红，王迪，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三O九医院，
类型：发明
国别省市：
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