用于诱变检测的测定法制造技术

本发明专利技术提供了用于测定试剂的致诱变性质的方法、系统和试剂盒。所述方法系统和试剂盒利用DEL选择标记和比色检测系统。还包括利用DEL选择标志物和检测线粒体活性的试剂的方法系统和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及诱变测定法和可用于其中的细胞和试剂盒。
技术介绍
公认化学剂的诱变潜力大致与该化学剂的致癌潜力大概成比例。早期确定特定试剂是否存在诱变性的危害对于开发用于化学、化妆品、食品添加剂和制药工业的产品开发是至关重要的。诱变剂是导致突变率(即，生物体的遗传物质中可检测和可遗传的结构改变)提高的试剂。这种改变可以包括整个染色体的添加或缺失，染色体的结构改变(例如，易位)以及一部分基因组序列的结构改变(例如，点突变、多个连续核苷酸的突变和部分基因组序列的缺失)。由于遗传改变可以损害或以其他方式干扰基因的作用，诱变剂被表征为基因毒素，即，对基因有毒性的作用剂。
技术实现思路
本专利技术提供了一种包含营养缺陷型基因的构建体，所述营养缺陷型基因被生色酶(colorigenic enzyme)基因破坏,所述生色酶基因被编码选择标记的多核苷酸破坏。在一个实施方案中，所述营养缺陷型基因包括His3基因。在另一个实施方案中，所述选择标记包括Ura3基因。在又一个实施方案中，所述构建体包括质粒。在一个实施方案中，所述构建体被重组引入至宿主细胞基因组中。还在另一个实施方案中，所述生色酶基因包括LacZ。还在另一个实施方案中，所述构建体包含选自由下列各项组成的组的序列(a) SEQ ID NOI ; (b)与SEQ ID NO : 195%相同的序列；(c) (a)或(b)的互补体；以及(d) (a)、(b)或(c)的序列，其中T可以是U。本专利技术还提供了一种被重组改造为包含上述构建体的宿主细胞。在一个实施方案中，所述宿主细胞是真核细胞。在另一个实施方案中，所述宿主细胞是酿酒酵母。本专利技术还提供了一种表征试剂的诱变性的方法，包括使包含上述构建体的宿主细胞与试剂接触，并测量￠-半乳糖苷酶的活性，其中与对照相比￠-半乳糖苷酶活性的提高指示试剂具有诱变潜力。本专利技术提供了一种表征测试试剂的方法，包括用测试试剂处理包含DEL选择标记的真核细胞；以及在用所述测试试剂处理所述真核细胞后测量线粒体活性。在一个方面，本专利技术利用MTT或MTS试剂来检测线粒体活性。在另一个方面，所述细胞是酵母细胞。本专利技术提供了一种表征测试试剂的方法，包括提供包含DEL选择标记的真核细胞培养物；用或不用测试试剂处理所述真核细胞培养物；在合适的选择培养基存在的情况下测量所述细胞培养物的被处理部分的线粒体活 性；以及在所述选择培养基存在的情况下测量所述细胞培养物的未处理部分的线粒体活性。在一个方面，本专利技术利用MTT或MTS试剂来检测线粒体活性。在又一个方面，所述细胞是酵母细胞。本专利技术还提供了一种包含细胞和线粒体活性检测试剂的试剂盒，所述细胞包含DEL选择标记。在下面的附图和说明书中列举了本专利技术的一个或多个实施方案的细节。从说明书和附图以及权利要求书中，本专利技术的其他特征、目的和优点将是显而易见的。附图说明图I显示了通过向-His培养基中的100，000个本底RS112细胞添加不同稀释度的RS112His+回复体来模拟DEL测定。对12、18和24小时时间点作图。在第12小时，对应于每10，000个细胞25、50和100次DEL事件的RS112His+添加可感知地显著。到了第18和24小时，均可明显地检测到每10，000个细胞少至2. 5次DEL事件。而在第24小时，尽管25-1000个RSl 12细胞仍然与本底显著不同，但在-His培养基中的生长变得饱和并且丧失反应模式。对于每个处理组使用至少6次重复来进行实验，并且结果表示为均值土SD。显著性 * (p < 0. 05)。图2A-C显示基于孔的DEL测定，其通过测量添加MTS后14h的0. D. (490nm)评价13种致癌物的细胞毒性和基因毒性。经处理样品的细胞毒性通过与标记为“RS112”的未处理酵母相比在+13培养基中的减弱生长来表示。基因毒性通过与未处理酵母相比在-HIS培养基中的生长增加来表示。在图A中，化合物先前使用DEL测定进行测试；图B，以前未由DEL测定表征的交联剂；图C，以前未由DEL测定表征的交联剂。在图A、B和C中进行的实验各自在单个384孔板中完成；对于每个处理组使用4次重复，并且结果表示为均值土 SD。每次产生相似结果时以96孔板和386孔板两种形式均重复实验至少3次。图3A-D是显示酵母染色体内重组(DEL)系统的结构和可能的回复突变机制的示意图。A :姐妹染色单体转换；B :单链复性；C :染色体内交换；D :不等性姐妹染色单体互换。具体实施例方式如在本文中和在附带的权利要求中使用时，单数形式“一个/种(a/an) ”和“该/所述(the)”包括复数指代物，除非文中另外清楚地说明。因此，例如，提及“一个/种细胞”时包括多个/种这样的细胞，并且提及“该/所述试剂”时包括提及本领域技术人员已知的一种或多种试剂，等等。此外，除非另外指明，“或”的使用意指“和/或”。类似地，“包括”、“包含”、“含有”、“具有”可互换使用并且不旨在是限制性的。还要进一步理解的是当对各个实施方案的说明使用术语“包括”时，本领域技术人员要理解在一些具体情况下，实施方案可选地可以使用“基本上由......组成”或“由......组成”的表述来描述。除非另外限定，本文中使用的所有技术和科学术语具有本专利技术所属领域中普通技术人员普遍理解的相同含义。尽管在公开的方法和组合物的实施中可以使用与本文所述的那些类似或等效的方法和材料，但在本文中仅说明示例性的方法、装置和材料。上文和全文中讨论的出版物仅因为它们在本申请申请日之前公开而提供。本文中的任何内容不应被解释为承认本专利技术人由于在先公开而没有权利占先于这些公开。最初作为研究DNA重组和修复机制的工具而开发的DEL测定已经经受了时间的考验，并且已经证明其本身在各个研究领域中是无价的工具-癌症、毒理学、环境科学、公共卫生、放射生物学和药理学。尽管仍然是研究DNA重组/修复途径和长期遗传不稳定性的优良模型，DEL测定法在早期就已经显示在试剂的致癌性检测方面非常敏感和准确，所述试剂在广泛接受的沙门氏菌属测定(Ames)中无法检测到。DEL测定法识别92%的已知致癌 物，而Ames测定仅识别60%。DEL测定法有效地预测具有截然不同的诱变活性机制的各种试剂和应激源的基因毒性和细胞毒性性质。其可以检测经由氧化应激、单链和双链DNA断裂、诱裂活性、UV-诱导的碱基二聚化、DNA交联、DNA堆积和低LET y辐射诱导遗传改变的试剂。最近DEL测定法还被用来研究内源性氧化应激诱导剂NHO并且证明了检测氧化应激中和剂诸如NAC (N-乙酰胺)的能力。HNO具有基因毒性，但其机制还未被充分阐明。存在HNO可以攻击DNA的许多可能机制。由于HNO是亲电子的，因此其可能与DNA碱基上的环外胺基反应并且通过一系列随后的反应形成脱胺产物。可选地，HNO可以通过0(2)-依赖性(或可能0(2)-非依赖性)化学诱导自由基化学。在无细胞系统中，实验已经显示HNO不与DNA反应，导致碱基氧化和链断裂。使用酵母酿酒酵母中的全细胞系统,利用Angeli盐作为HNO供体，研究HNO诱导的DNA损害的机制。酵母DEL测定法提供了一种对导致DNA缺失的染色体内重组的测量手段。HNO是DNA缺失和重组的有效诱导物，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗伯特·H·席斯特尔，尼科斯·霍恩特吉亚斯，库尔特·M·哈弗，伊里·奥布雷赫特，叶连娜·O·里维纳，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：