本发明专利技术属于微生物基因工程技术领域，具体公开了一种来自于苏云金芽胞杆菌幕虫亚种YBT-020晶胞粘连控制基因簇的分离、克隆及其在防止晶体降解中的作用。本发明专利技术从具有典型晶胞粘连表型的苏云金芽胞杆菌YBT-020中克隆得到控制其晶胞粘连表型的基因簇，共有5个基因组成，其编码的蛋白质的序列如序列表SEQ?ID?NO：2-6所示。该基因簇和晶体蛋白基因cry26Aa在无晶体突变株BMB171中共表达时，可以使晶体形成在芽胞外壁的内侧；当母细胞裂解后，由于晶体被芽胞外壁包裹，可以有效的抑制晶体蛋白的降解。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属农业微生物基因工程
具体涉及晶胞粘连表型控制基因簇的分离、克隆以及它编码的产物在防止晶体蛋白降解中的应用，本专利技术还与微生物农药
相关。
技术介绍
苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是ー种广泛存在于各种生态环境中的革兰氏阳性杆状细菌。该物种最大的特点就是在其生长周期中能形成内生芽胞的休眠体，并且在其芽胞形成的同时能产生对许多昆虫具有特异毒性的由杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins, ICPs)组成的伴胞晶体。这些杀虫晶体蛋白对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目等昆虫纲10个目500多种昆虫以及原生动物、线形动物门、扁形动物门中某些有害种类也有特异的生物活性(Schnepf H E，Crickmore N, Rie J V,Lereclus D,Baum J,Feitelson J,Zeigler D R,Dean D H. 1998. Bacillus thuringiensisand its pesticidal crystal proteins. Microbiol Mol Biol Rev, 62 :775-806)。由于苏云金芽胞杆菌对多种昆虫都有很高的杀虫活性，而且具有对环境和人蓄无损害等优点，因此被广泛地应用于生物农药的开发。目前，基于苏云金芽胞杆菌开发的生物杀虫剂已经成为最成功的ー种生物农药，占到了整个生物农药行业90%以上的市场，广泛地应用于农业、林业和仓储等害虫的防治。B. thuringiensis的伴胞晶体是在芽胞形成期(sporulation)合成并累积而成。芽胞的形成可分为7个时期，一般在芽胞形成的第二期晶体蛋白开始表达，随着芽胞的进ー步发育，晶体蛋白逐渐累积，并形成具有晶格结构的伴胞晶体。当芽胞成熟以后，母细胞自溶，释放出芽胞和伴胞晶体。在绝大多数B. thuringiensis中，伴胞晶体是在母细胞中形成的，在空间上与芽胞无关。一旦芽胞成熟并且细胞自溶后，芽胞和伴胞晶体都释放出来，彼此相互独立。在少数B. thuringiensis的亚种中，芽胞成熟母细胞自溶后，伴胞晶体和芽胞彼此不分离，光学显微镜镜下观察两者是粘连在一起的(简称晶胞粘连)，例如幕虫亚种U i F,Zhu Y,Ju S,Znang R,Yu Z,Sun M. 2009. Promoters of crystal protein genes donot control crystal formation inside exosporium of Bacillus thuringiensis ssp.finitimus strain YBT-020· FEMS Microbiol Lett，300(I) :11-17)。蜡状芽胞杆菌群(包括蜡状芽胞杆菌(B.cereus，简称Be)、炭疽芽胞杆菌(B. anthracis,简称 Ba)和苏云金芽胞杆菌(B. thuringiensis,简称 Bt))与 B. subtilis相比，其芽胞结构有一个明显的差异，前者在芽胞衣(coat)外还有ー层芽胞外壁(,exosporium) (Henriques A O,Moran C P Jr 2007. Structure, assembly, and function ofthe spore surface layers. Annu Rev Microbiol,61 :555-588)。大多数B. thuringiensis的伴胞晶体是在芽胞外壁外侧形成的，而幕虫亚种的伴胞晶体则在芽胞外壁和芽胞衣之间形成，从而导致晶胞粘连表型的产生。 目前，苏云金芽胞杆菌应用主要包括两个途径，一种是将苏云金芽胞杆菌的杀虫晶体蛋白基因转入植物中，构建转基因植物，用于农业害虫的防治(Pigott CR and EllarDJ. 2007. Role of receptors in Bacillus thuringiensis crystal toxin activity.Microbiol Mol Biol Rev 71 :255-281);另一种是做成可以在环境中释放的生物杀虫剂。在户外使用过程中，由于晶体蛋白本身对紫外线敏感，在环境中容易被降解掉从而降低杀虫的活性。让杀虫晶体蛋白定位于芽胞外壁的内侧，制成生物囊杀虫剂，是ー种具有潜力的防止晶体过快降解的方法；当母细胞裂解后形成晶胞粘连，在环境中释放时由于受到芽胞外壁的保护，可以延长作用时间。对于晶胞粘连机制的研究为这种设想可以提供理论基础。晶胞粘连表型被鉴定出来已有半个世纪之久(Hannay C L. 1961. Fowler ' sbacillus and its parasporal body. J Biophys Biochem Cytol,9 :285-298. ), Debro 等通过质粒消除和接合转移实验证明晶胞粘连表型和ー个大小约98MDa的质粒紧密连锁，因此他们推測这个质粒包含了控制晶胞粘连表型所需的所有基因，在这个菌株中粘连的晶体主要由大小 135kDa 的晶体蛋白组成(Debro L, Fitz-James P C, Aronson A. 1986. Twodifferent parasporal inclusions are produced by Bacillus thuringiensis subsp.finitimus. J Bacteriol, 165 :258-268)。在苏云金芽胞杆菌幕虫亚种B-1166VKPM菌株中共克隆到两类晶体蛋白基因cry26Aal和cry28Aal，分别编码大小约1163和1109个氨基酸(ffojciechowska J A, Lewitin E, Revina L P, Zalunin I A, Chestukhina G G. 1999. Twonovel delta—enaotoxin gene iamilies cry26 and cry28 irom B&ci丄丄us thuringiensisssp. finitimus. FEBS Lett,453 :46-48)。Vidal-Quist 等在对西班牙一个果园生境中分离纯化得到的芽胞杆菌表型镜检观察发现，在分离的376株芽胞杆菌中有25株表象出晶胞粘连表型，这25株菌的晶胞粘连表型可以分成4个类型，通过SDS-PAGE显示每种类型都有不同的晶体蛋白构成(Vidal-Quist J C, Castanera P, Gonzalez-Cabrera J. 2009.Diversity of Bacillus thuringiensis strains isolated from citrus orchards inSpain and evaluation of their insecticidal activity against Ceratitis capitata.J Microbiol Biotechnol，19 :749-759)。这说明晶胞粘连表型涉及的晶体蛋白具有多样性Aronson(Aronson A. 2002. Sporul本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.晶胞粘连表型控制的基因族，它的核昔酸序列如序列表SEQID N0:1所不,其中 orfl基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1中第703-1605位所示； orf2基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1中第1707-2513位所示； orf3基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1中第2878-4320位所示； orf4基因的核苷酸序列如序列表S...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙明，朱义广，纪芳，尚卉，朱倩，王鹏霞，徐承晨，邓运，付菁菁，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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