一种胰岛素前体的表达载体转化方法技术

本发明专利技术公开了一种胰岛素前体的表达载体转化方法，步骤为：将含有基因工程甘精胰岛素前体的表达载体质粒的大肠杆菌单克隆菌落接入胰酶大豆肉汤中培养，离心收集菌体；将菌体溶解到缓冲液中，将细菌裂解，收集甘精胰岛素融合蛋白包含体，再溶解入含脲素的缓冲液中；向溶液中加入钴离子亲合树酯，搅拌混匀，使其结合长效胰岛素融合蛋白，离心收集金属亲合树酯；将收集的钴离子亲合树酯，用脲素的缓冲液冲洗金属亲合树酯数次，最后用缓冲液将结合的长效胰岛素融合蛋白洗脱，分别取样进行蛋白电泳检测胰岛素融合蛋白的合成。本发明专利技术具有提高生产效率、降低生产成本的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种胰岛素前体的表达载体转化的方法，属基因工程和分子生物学
本专利技术提供一种在不使用化学诱导物和不添加任何抗生素的条件下，得到高效、可靠的体内转化表达，并可进行连续培养制备长效胰岛素融合蛋白的方法。
技术介绍
糖尿病是一种常见的内分泌代谢疾病。近年来，糖尿病正以前所未有之势席卷全球。在中国，随着人民生活水平提高和生活方式的改变，糖尿病患病率正快速升高，并呈现发病年轻化的趋势。据统计，我国已经确诊的糖尿病患者人数高达9240万人，成为世界上糖尿病患者最多的国家。严重危害人民健康。糖尿病的急慢性并发症，尤其是慢性并发症，致残、致死率高，严重影响患者的身心健康，并给个人、家庭和社会带来沉重的负担。在糖尿病治疗中，胰岛素对控制血糖达标、预防并发症具有不可替代的作用，也是目前最为有效的糖尿病治疗手段之一。近年来，随着胰岛素技术的发展，开发出了胰岛素类似物。其中一种长效胰岛素类似物-甘精胰岛素，正在被越来越多的医生和患者接受和使用。重组甘精胰岛素是利用重组DNA技术生产的生物合成人胰岛素类似物。它是在人胰岛素B链羧基末端增加了两个精氨酸，同时也把A链羧基末端A21位置的天冬酰胺替换成甘氨酸，皮下注射后，因酸性溶液被中和而形成的微小沉淀可持续缓慢释放重组甘精胰岛素，继之吸收入血液也慢，从而产生长达24小时平稳无峰值的可预见的血药浓度。因此，每天定时皮下注射一次，即可满足人体对基础胰岛素的需要。总之，在持续改善血糖控制的情况下，重组甘精胰岛素可降低低血糖症发生率，提高患者生活质量，同时不增加治疗费用。在重组胰岛素上，目前为两种表达系统，一为大肠杆菌包涵体表达系统，主要为礼来公司和赛诺菲安万特公司应用，代表性的胰岛素产品是重组人胰岛素、赖脯胰岛素以及甘精胰岛素，这种技术较为成熟，开发较早。大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工。对包涵体变复性以及对胰酶和羧肽酶B进行酶切，然后通过离子交换层析和反相层析进行精纯。另一种为酵母表达系统，主要为丹麦诺和诺德公司所采用，使用具有翻译后修饰的酿酒酵母作为表达系统，省去了包涵体变复性的繁琐及高消耗操作步骤，代表性的产品是重组人胰岛素、门冬胰岛素以及地特胰岛素。我们在对基因重组长效人胰岛素类似物的研究工作中采用了大肠杆菌包涵体表达系统。大肠杆菌是研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达。基因重组长效人胰岛素类似物的生产制备首先需要人工构建合成甘精胰岛素的表达载体，为胰岛素类似物的批量生产提供基础。而本专利技术关键目的就是将基因工程胰岛素前体的表达载体转化到高表达大肠杆菌。我们在研发过程可发现了一种不需用任何抗生素且可进行连续培养的表达方法。依据天然人胰岛素的氨基酸序列，合成优化了基因D N A片段，通过PCR扩增，分别将产物和质粒经双酶切处理后连接，形成胰岛素表达的载体质粒母体。再通过基因工程，将人胰岛素基因A、B链的人工合成基因分别组合到大肠杆菌的不同质粒上，然后移至菌体内，进行复制和表达，从而使带有A、B链基因的工程菌株分别产生人胰岛素A、B链，再用人工的方法，在体外通过二硫键使这两条链连接成有活性的人胰岛素。基因工程人胰岛素的一级结构 基因工程正常(中间)人胰岛素的结构如图I所示，基因工程长效胰岛素的结构如图2所示。 基因工程长效胰岛素前体基因序列TTC GTC AAT CAG CAC CTT TGT GGT TCT CAC CTC GTT GM GCT TTG TAC CTT GTT TGCGGT GM CGT GGT TTC TTC TAC ACT CCT AAG ACT CGT CGT GAA GCT GAA GAC CTC CAG GTTGGT CAG GTT GM CTC GGT GGT GGT CCT GGT GCT GGT TCT CTT CAA CCT CTT GCT CTT GAAGGT TCT CTT CAG AAG CGT GGC ATC GTT GAA CAG TGT TGC ACA TCT ATC TGC TCT CTTTAC CAG CTT GAG AAC TAC TGT GGT TAA TAA
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，在初步构建好胰岛素的表达载体后，进一步将构建好的表达载体转化到大肠杆菌的有效的方法。为达到上述目的，本专利技术的技术方案是提供，具体步骤为 A :将含有基因工程甘精胰岛素前体的表达载体质粒的大肠杆菌单克隆菌落接入胰酶大豆肉汤中，在摇床中培养 ，培养的温度为25-40° C，转速200-300RPM，培养15-30小时后，通过离心的方法收集菌体； B :将第一步离心收集的菌体溶解到10-20 mM Tris缓冲液，超声细菌裂解，然后将裂解物在4° C、离心力为6000g的条件下离心30-45分钟，之后收集甘精胰岛素融合蛋白包涵体，将其所收集的甘精胰岛素融合蛋白包涵体溶解到含6-8 M脲素的10-20 mM Tris缓冲液中，然后向溶液中加入金属亲合树酯，搅拌混匀，使其结合甘精胰岛素融合蛋白，最后通过离心的方法收集金属亲合树酯； C :将第二步离心收集的金属亲合树酯，用6-8 M脲素的10-20mM Tris缓冲液冲洗金属亲合树酯数次，以去除杂质，最后用含有100-200 mM咪唑和6_8 M脲素的10-20 mMTris缓冲液将结合的甘精胰岛素融合蛋白洗脱，分别取样进行蛋白电泳检测胰岛素融合蛋白的合成。本专利技术的进一步改进在于此方法中使用的缓冲液的pH值为8-10， 本专利技术的进一步改进在于步骤B中的金属亲合树酯为钴离子或镍离子亲合树酯。本专利技术首先以含胰岛素前体的表达载体为初始靶标，通过表达载体转化到大肠杆菌；然后在大肠杆菌中大量高效克隆，从而能够得到大量重组胰岛素。综合以上就可以筛选到可靠的高表达的含胰岛素前体的物质。本专利技术具有以下优点(1)、生产过程可不需用任何抗生素将含有表达载体质粒的细菌分为两份接种到胰酶大豆肉汤摇床培养，一份加入含50μ8/πι1卡那霉素，而另一份不加任何抗生素。结果发现在不使用抗生素的条件下重组融合蛋白的表达量与使用抗生素的培养几乎没有多大差别。这表明此表达系统在大肠杆菌体内非常稳定，有利于生产工艺的简化； (2)、表达载体稳定，可进行连续培养将携带甘精胰岛素基因质粒大肠杆菌无抗生素培养，连续培养2天，质粒几乎无丢失，连续培养4天，含有质粒的细菌量仍占60%以上。重组蛋白的表达量与含有质粒的细菌量成正比； (3)、不需用化学诱导物；将含有表达载体质粒的细菌接种到胰酶大豆肉汤摇床分为两份培养，一份加入ImMIPTG诱导物，而另一份不加诱导物。取样进行蛋白电泳检测胰岛素融合蛋白的合成，结果发现没有加诱导物的培养照常能合成大量的胰岛素融合蛋白。尽管加诱导物的培养胰岛素融合蛋白合成量占细菌总蛋白的百分比稍多于未使用诱导物的培养，但由于诱导物的使用大大的抑制了细菌的生长，其单位体积培养液胰岛素融合蛋白合成量远远低于未使用诱导物的培养。这一特点不仅有可能简化生产工艺，而且可以不需要昂贵的化学诱导物，从而可提高生产效率，降低生产成本。具体实施例方式为了加深对本专利技术的理本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：牛洪森，周立庆，左聪，季春香，
申请(专利权)人：麦科罗夫南通生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：