本发明专利技术公开了一种靶向人感染乙型肝炎病毒肝细胞的核酸适配子及其序列，属于基因工程与生物医药领域。本发明专利技术应用新的组合化学技术SELEX，以乙型肝炎病毒表面抗原为靶蛋白，从单链RNA随机文库中筛选出了能与乙型肝炎病毒表面抗原特异性结合的RNA适配子，其核苷酸序列为：5’-GUUGAUUGCGUGUCAAUCAUGGCCGUCUAUAAUGAUCGUAAACGACGGGUCAUGUGUAUGUUGGGGAUUGGGACCUGAUUGAGUUCAGCCCACAUAC-3’。该适配子在其随机序列区域能形成特殊的茎环结构，能特异性、高亲和力地结合乙型肝炎病毒表面抗原或靶向结合至感染乙型肝炎病毒的肝细胞。该RNA适配子为乙肝诊疗领域提供了一种特异高效的标记分子，并为开发慢性乙型肝炎诊断试剂与治疗药物提供了新的选择。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程与生物医药领域。本专利技术涉及利用SELEX技术筛选获得的一种靶向感染乙型肝炎病毒肝细胞的核酸适配子，以及此适配子的核苷酸序列。
技术介绍
乙型肝炎病毒Ofepatitis B Virus, HBV)感染是导致慢性肝炎、肝硬化和肝细胞肝癌的重要原因之一，全球3. 5亿慢性HBV感染者中约75%分布在亚洲，而我国又是全球 HBV感染人数最多的国家。因此，针对乙型肝炎的防治研究一直是我国医疗卫生科研的重要领域。虽然国内乙肝疫苗的计划免疫大大降低了乙肝的发病率，但是对已经存在的HBV慢性感染仍缺乏长期有效的抗病毒药物，且大多数药物并非特异性作用于肝脏。将药物与肝脏靶向性载体结合，使其选择性靶向到特定的肝细胞，从而使药物更高效地传递到肝脏、更好地发挥药物的治疗作用是极具前景的治疗方案。HBV感染肝细胞后能够在感染细胞表面表达病毒的表面抗原HBsAg，利用HBsAg作为靶子，将治疗药物运送到感染细胞内发挥作用是非常有前景的一种治疗设想。SELEX 技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment) 是20世纪90年代初-发展起来的一种新的组合化学技术。它利用大容量的随机寡核苷酸库与靶分子相互作用，从中筛选出与靶分子特异结合的寡核苷酸，并结合PCR体外扩增技术，使其得到指数级富集，经过多轮筛选，最终获得高亲和力、高特异性的寡核苷酸适配子。 相对于传统意义上的蛋白质抗体分子，经SELEX筛选得到的寡核苷酸适配子分子更小，免疫原性低，能更快渗入细胞，是极具潜力的预防、诊断和治疗疾病的新型试剂。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种RNA适配子，通过特异性结合肝脏中感染乙型肝炎病毒的肝细胞来实现乙肝治疗药物运送的靶向性，可用于慢性乙型肝炎的诊断与治疗。本专利技术采用以下技术方案体外合成一个长度为97核苷酸的含有25个随机序列的单链DNA文库，通过体外转录构建出单链RNA适配子随机文库；采用酵母表达的方法体外表达乙型肝炎病毒表面蛋白，以其为靶蛋白，采用SELEX技术筛选具有高亲和力的HBsAg特异性RNA适配子；通过结构预测软件RNA Structure Program分析预测适配子的二级结构；通过膜结合测定实验、凝胶阻滞实验鉴定筛选适配子对靶蛋白的特异性和亲和力，得到了一个与HBsAg亲和力高、 特异性强的适配子，命名为S-A22 ；该RNA适配子的核苷酸序列为5’ -GUUGAUUGCGUGUCAA UCAUGGCCGUCUAUAAUGAUCGUAAACGACGG⑶CAUGUGUAUG UGGGGAUUGGGACCUGAUUGAGUUCAGCCCACA UAC-3’，能形成茎环结构。该适配子能特异性、高亲和力地结合乙型肝炎病毒表面蛋白或靶向结合至感染乙型肝炎病毒的肝细胞。ELISA实验证实该适配子能特异竞争乙型肝炎病毒表面抗原与抗体的结合。本专利技术的有益效果(1)获得了一种能够特异高效结合乙型肝炎病毒表面抗原的适配子。该适配子可以大量人工制备，方法简单，成本低廉(2)为进一步筛选以核酸适配子为基础的慢性乙型肝炎诊断和治疗药物奠定了基石出。附图说明图1 是SELEX筛选乙型肝炎病毒表面抗原特异性结合核酸适配子的流程图。图2 是筛选获得的核酸适配子的二级结构分析图。其中图2箭头所指为适配子的随机序列区域，该区域形成了一个特殊的茎环结构。图3 说明了经过12轮筛选富集的RNA文库能够特异性高亲和力结合乙型肝炎病毒表面抗原的结果图。其中左图为膜结合实验检测不同轮次文库与HBsAg的结合能力，显示了第12轮文库与HBsAg间结合的高亲和力；右图为第12轮文库与HBsAg结合的凝胶阻滞实验。图4 竞争ELISA实验显示适配子S-A22能够阻断HBsAg与HBsAb的结合，说明 S-A22与HBsAg结合后可能封闭了 HBsAg与HBsAb的结合位点。具体实施例方式以下结合说明书附图和实施例对本专利技术作进一步的说明，但不是限制本专利技术。实施例IHl蛋白特异性结合RNA适配子的SELEX筛选SELEX筛选过程如图1所示，化学合成初始寡核苷酸随机文库及引物，序列如下 5' -TTAATACGACTCACTATAGTTGATTGCGTGTCAATCATGG-25N-GGTCATGTGTATGTTGGGGATTAGGACC TGATTGAGTTCAGCCCACATAC-3 ‘ (25N 代表 25 个随机核苷酸)；应用引物 1 5 ‘ -TTAATACGACTCACTATAGTTGATTGCGTGTCAATC-3 ‘，引物2 :5 ‘ -GTATGTGGGCTGAACTCAAT-3 ‘。将单链DNA文库扩增为双链DNA,产物经2%琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；以回收的双链DNA为模板，体外转录出单链RNA随机文库，转录产物经PAGE纯化。68 μ g RNA文库经硝酸纤维素膜反筛去除与膜结合的RNA 分子，然后与2yg HBsAg 37°C孵育40min，反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜；然后将滤膜剪碎，置于洗脱缓冲液(7mol/L尿素，0. 5mol/L醋酸铵，lmmol/L EDTA,0. 2% SDS)中煮沸5min，离心，取上清，无水乙醇沉淀RNA，并重新溶解于20 μ 1 DEPC水中；以RNA为模板 RT-PCR扩增双链DNA，体外转录出RNA文库用于下一轮筛选；每轮筛选过程中RT-PCR得到大小为115bp双链DNA文库，以该双链DNA为模板体外转录出97nt的RNA适配子库，筛选共进行12轮。 实施例2RNA适配子的二级结构分析将第12轮筛选得到的文库克隆至pMD19-T载体，转化至大肠杆菌DH5ci，随机挑选48个克隆，测序。获得所筛选适配子的序列信息，通过结构预测软件RNA Structure Program预测所有测序克隆的RNA 二级结构，获得一种适配子其在随机序列区域(23_47nt) 可以形成一个特殊的茎环结构，如图2所示。实施例3特异性高亲和力的HBsAg结合适配子的获得4将具有上述二级结构的RNA适配子分别取1 μ g，用牛小肠碱性磷酸酶(CIP) 37°C 消化lh，纯化回收去磷酸化的RNA ；通过T4多核苷酸激酶标记[Y -32PlATP于去磷酸化的 RNA分子末端。IOnmol放射性标记的RNA适配子分别与不同浓度(10_200nM)的HBsAg37°C 孵育40min，各组反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量，同一样品平行做两次测定。计算各个适配子与HBsAg的解离常数，获得亲和力最高的适配子，命名为S-A22。32P标记的第5轮文库R5、第6轮文库R6、第10轮文库RlO 以及第12轮文库R12分别与HBsAg在37°C孵育40min，各组反应液经硝酸纤维素膜滤过， 洗涤滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量，同一样品平行做两次测定。同样分组的孵育后反应液上样至6%非变性PAGE凝胶，120V电泳池，取出凝胶，磷屏成像，结果如图3所示。实施例4适配子S-A22阻断HBsAg与HBsAb的结合能力体外转录2，氟修饰的适配子S-A22、S-A21以及不同轮次R本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨燕，杨东亮，刘嘉，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属同济医院，
类型：发明
国别省市：
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