本发明专利技术属于植物生物技术领域，特别提供了克隆自辣椒的1个多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因CaPGIP1，该基因能特异的抑制病原菌分泌的多聚半乳糖醛酸酶（PGs）活性，本发明专利技术提供该基因编码的蛋白制作、酶活测定、基因沉默、转基因过量表达等功能验证技术及其应用。立足于基因和蛋白质操作技术，证明了CaPGIP1基因有效的参与了胁迫因子诱导辣椒的防卫反应，并对多种病原菌分泌的多聚半乳糖醛酸酶（PGs）活性具抑制效果。利用基因沉默和转基因技术进一步证明了该基因在辣椒中沉默或少量表达降低了寄主的抗病性，而在转基因烟草中过量表达使其抗性增强，因此该基因编码一种重要的抗病相关蛋白。本发明专利技术为转化多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（PGIP）基因和培育抗病新品种提供了重要的技术储备。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属分子生物学领域，具体地说，本专利技术涉及一种多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因CaPGIPl的基因克隆、功能验证及其应用技术。
技术介绍
植物病原菌与寄主互作过程中，可分泌多种细胞壁降解酶，主要包括多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶酸盐裂解酶(Pel)、果胶甲基酯酶(Rne)和β _半乳糖苷酶(LacZ)，其中 PG是重要的细胞壁降解酶，这些酶类主要通过降解细胞壁的重要组分果胶而破坏细胞壁， 促进病菌的侵染致病，导致寄主产生病变症状或加速病程发展，同时为病原菌的生长和繁殖提供糖源营养，多项研究证明了 PG在植物病原菌侵染寄主及其病程中的重要作用。研究发现多种植物含多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白PGIP基因，PGIP基因是一种富含亮氨酸重复(LRRs)的特异性细胞壁结合蛋白，能专一地抑制病原菌内切型Pk活性，该类蛋白与PG特异性结合能有效的促进植物体内与抗性有关的寡聚半乳糖醛酸(OGs)的积累，而有效地激活植物的防御系统和抗病信号转导，增强植物的抗病性，从而阻断病菌侵染寄主和抑制病程的发生与发展。PGIP与病原真菌分泌的内切型PG结合，减少了内切型PG对植物细胞壁的降解，有助于维护植物细胞壁的完整性，使其不易被病原真菌分泌的其它水解酶所渗透，减缓了细胞壁的降解，减少了可供病原真菌利用的养分，进而抑制了病菌的定殖与繁殖，增强了植物的抗病性。在对PGIP特性充分认识的基础上，借助基因和蛋白操作技术，人类首次从菜豆下胚轴、番茄茎和桐叶槭悬浮培养细胞的蛋白提取物中发现了 PGIP， 并证明了该类蛋白能抑制植物病原真菌分泌的PG活性，随后从菜豆中克隆了 2个PGIP基因，两者均编码342个氨基酸残基，含四个氨基酸残基的信号肽和313个氨基酸残基的成熟肽，随后研究发现将外源PGIP基因整合到植物基因组中，使其进行组成型表达，可提高植物的抗病性，从而为进一步克隆PGIP基因及利用该类基因改良作物抗病性提供了技术储备。在世界范围内，鉴于PGIP基因可增强植物的抗病性，该类基因的研究已显现出强劲的发展势头，国外许多公司已把多个PGIP基因转入目的植物，改良或增强植物抗病性， 获得抗病植物，抑制了病害的发生，减少了农药使用量，产生了巨大经济效益。但是现有技术中还未公开过辣椒多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白PGIP基因对植物病原菌分泌的多聚半乳糖醛酸酶PG活性抑制作用及其转基因植物抗病性提高的研究资料信息。
技术实现思路
基于上述的原因，本专利技术提供了 1个克隆自辣椒的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因CaPGIPl及其蛋白质制作、酶活测定、功能验证及其应用操作技术。依据基因和蛋白操作技术，证明了该基因能有效的抑制病原真菌分泌的多聚半乳糖醛酸酶(PGs)活性，抑制病菌的侵染，提高植物的抗病性。在此基础上，借助基因沉默技术证明了 CaPGIPl基因的功能缺失，使辣椒的抗病性降低，而转基因技术表明CaPGIPl基因在烟草中的过量表达可提高其抗病性。因此，该基因在植物的抗病性中扮演了重要的角色，本专利技术为进一步挖掘PGIP 基因资源及系统开展转PGIP基因植物技术研发和培育抗病新品种提供重要的技术储备。本专利技术提供的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因CaPGIPl，其特征在于其基因序列如kqlD No 1所示；其氨基酸序列为SEQ ID NO 2所示，该基因编码的蛋白质能有效的抑制病原真菌分泌的多聚半乳糖醛酸酶活性。该基因开放阅读框有1038个碱基，编码一种含有345个氨基酸的蛋白质，分子量为38. 8kDa，有36个氨基酸的信号肽，4个N-糖基化位点(分别为SEQ ID NO :2序列中的 121，145，159，306氨基酸)，无内含子。该基因的具体克隆制备方法为1、CaPGIPl 基因克隆A 辣椒基因组DNA提取，采用CTAB法，辣椒品种为克星3号；B :PCR获得目的基因根据NCBI数据库上所有植物PGIP基因保守序列，设计兼并引物PGIPl-I (其序列如Seq ID No 3所示)和PGIP1_2(其序列如Seq ID No 4所示)， PCR扩增得到423bp基因片段；C =Tail-PCR方法获得基因5’和3’段，获得目的基因开放阅读框。2、CaPGIPl基因表达差异分析A 样品准备，取辣椒不同组织器官(根、茎、叶、花、果实)，-80°C保存；胁迫因子 (水杨酸、茉莉酸甲酯、脱落酸、创伤、冷冻)处理4-6叶期辣椒叶片，0、1、2、6、12、18、M、36、 48h后取样；B 总RNA抽提，根据RNA提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)；C 反转录合成cDNA第一链；D 根据CaPGIPl基因序列，设计特异引物PGIPlF-qPCR(其序列如Seq ID No 15 所示)和PGIPlR_qPCR(其序列如kq ID No :16所示)，荧光定量PCR检测不同处理在不同处理阶段的基因表达差异。3、基因原核表达与蛋白纯化A =CaPGIPl基因蛋白表达根据CaPGIPl基因序列设计特异引物PGIP1-YHSP (其序列如kq ID No :17所示) 和PGIP1-YHASP (其序列如kq ID No 18所示)，构建基因原核表达载体pET28a_CaPGIPl ； 转化大肠杆菌!"rans-rosetta感受态细胞，筛选抗卡那霉素的转化子；异丙基硫代-β -D半乳糖苷(IPTG)诱导获得原核表达蛋白；B =CaPGIPl基因蛋白纯化，将表达蛋白过Ni-NTA凝胶树脂，洗脱获得纯化蛋白。4、PGs-CaPGIPl 活性测定A 植物病原菌的准备，收集并培养玉米纹枯、玉米大斑、玉米弯孢霉叶斑、小麦赤霉、小麦全蚀、小麦根腐、小麦纹枯、辣椒疫霉、大豆疫霉、黄瓜疫霉、烟草疫霉和荔枝霜疫霉病菌；B =PGs诱导，分别用果胶诱导获得粗Pk溶液；C =D-半乳糖醛酸标准曲线的制作，绘制lmg/ml的D-半乳糖醛酸溶液ODMOnm标准曲线；D =CaPGIPl对不同Pk活性抑制效果测定，紫外分光光度法检测CaPGIPl对不同参试病菌P^活性抑制效果差异。5、辣椒体内CaPGIPl基因沉默A 转化载体的构建，设计特异引物GS12SP(其序列如kq ID No :19所示)和 GS12ASP (其序列如kq ID No :20所示)，构建沉默表达载体pTRV2_CaPGIPl ；B 菌体收集及侵染，提取上述重组表达载体质粒，转化农杆菌GV3101感受态细胞，筛选抗利福平及卡那霉素的转化子，阳性农杆菌转化子利用LB液体培养基(含卡那霉素和利福平各50mg/ml)震荡培养，收集菌体后，用无菌注射器将农杆菌悬浮液注入辣椒叶片中，使辣椒体内CaPGIPl基因进行瞬时沉默；C 荧光定量PCR检测沉默植株CaPGIPl基因的表达情况，3-4周后荧光定量PCR检测基因表达量变化；D 接种检测沉默植株抗病性情况，接种辣椒疫霉菌株，检测辣椒寄主的抗性变化。6、烟草体内CaPGIPl基因过量表达及其抗性检测A 遗传转化载体的构建，设计特异引物OElSP (其序列如kq ID No :21所示)和 OElASP (其序列如Seq ID No 22所示)，构建沉默表达载体pROK II-CaPGIPl ；B 农杆菌介导的遗传转化，提取上述重组表达载体质粒，转化农杆菌LBA4404感受本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因ＣａＰＧＩＰ１，其特征在于：其基因序列如Ｓｅｑ ＩＤ Ｎｏ：１所示；其氨基酸序列为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２所示，该基因编码的蛋白质能有效的抑制病原真菌分泌的多聚半乳糖醛酸酶活性。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张修国，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：37
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。