本发明专利技术公开了小麦TaTOC1基因及其克隆方法和应用，包括TaTOC1-A、TaTOC1-B、TaTOC1-D，TaTOC1-A核苷酸序列为SEQ?ID?NO：1；TaTOC1-B核苷酸序列为SEQID?NO：2；TaTOC1-D核苷酸序列为SEQ?ID?NO：3，根据本发明专利技术，从小麦中分离到了TaTOC1-A、TaTOC1-B、TaTOC1-D基因，三个基因过量表达能导致转基因拟南芥延迟一周左右开花，它们沉默表达会引起转基因小麦提前5天左右抽穗。小麦是世界性的重要粮食作物，将该基因转入小麦使其降低表达能够调节小麦的抽穗时间，具有非常重要的经济效益和社会效益。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及小麦TaTOCl基因及其克隆方法与应用，属于农作物转基因
技术介绍
植物由营养生长阶段向生殖生长阶段的转变，即成花转变，是植物完成整个生活周期的关键步骤。植物开花时间受内在发育信号和外部的环境信号共同控制。近些年来的研究表明，主要有四条途径控制开花，分别为光周期促进途径、自主促进途径、春化促进途径和GA促进途径。光周期现象是生物钟调控的诸多过程的一个特例，它是由生物钟和光信号共同作用的结果。光周期的感应器可以使植物准确地感知日照长度的变化，从而选择性地在合适的季节开花。过量表达LHY/CCA1和TOCl三个基因中的任一个都会导致转基因植株的昼夜节律性的破坏(Schaffer et al., 1998 ；ffang and Tobin, 1998),这说明它们是植物中心振荡器的核心 元件。TOCl基因属于拟南芥PRR基因家族，它编码的蛋白含有非典型的接收域(pseudo-receiver domain)和 CCT(CO, COL, and T0C1)结构域(Makino etal.，2000)，采用模式化和聚类分析的方法证明了这两个结构域可能分别发挥响应信号和转录调控的功能(Kolmos et al.，2008)。TOCl基因的mRNA和蛋白水平呈现昼夜节律性的积累，这种情况即使是在持续光照或持续黑暗的条件下依然表现的很明显(Strayer etal.,2000 ；Mas et al.，2003b)。但最近的研究发现，TOCl在持续光照条件下的昼夜节律性表达的现象在拟南芥的根里并没有被检测到，而在茎中却有很明显的节律性的TOClmRNA量的积累，这说明TOCl在不同器官中的作用模式很可能不同，这也用分子的证据说明植物不同器官的生物钟是具有特异性的，但并不排除不同器官的生物钟之间的相互联系与调控(James et al.,2008)。拟南芥TOCl的第562位丙氨酸突变成缬氨酸后产生了 tocl_l，它是一种弱的功能缺失型突变体，tocl-Ι的生物钟的昼夜节律周期相对于野生型拟南芥变短(Somers etal.，1998 ；Strayer et al.，2000)。而拟南芥中增加TOCl的表达时，植株的生物钟周期变长；当TOCl被过量表达时，转基因拟南芥的生物钟则完全变得紊乱(Makino et al.，2002 ；Mas et al.，2003a)。这些都说明TOCl在维持生物钟正常节律方面的重要功能。因此，可以利用植物转基因技术来调节植物的生长发育周期。长日照植物小麦是世界上重要的粮食作物之一。人们试图通过对育种和栽培方式的探索来改善其产量和品质。传统的主要育种手段之一是引种，即把外地或外国优良的作物品种引入当地，作为推广品种或是育种材料应用。但是小麦要完成从种子到种子的一个生长发育周期，必须通过春化阶段和光照阶段，否则就不能正常结实获取产量。但是由于全球各地的光照、温度等气候条件差异很大，所以引种工作受到很大的限制。如果能够利用生物技术手段调节小麦的生长发育周期，那么引种的范围就能够极大的扩大。小麦是最重要的粮食作物之一，是人类食物和营养的基本来源。依赖于基因工程的进展可以解决目前我国小麦生产面临的干旱、病虫害以及遗传育种中优良品种引种范围窄等问题。由于小麦的遗传背景较其它作物复杂，遗传转化困难，因此是三个重要的禾本科作物中最后一个获得转基因成功的。尽管从1992年以来利用基因枪法、花粉管通道法、农杆菌介导法、PEG法、电击法和激光微束法分别获得了转基因小麦，但其转化率未超过6 %。由基因枪法等物理转化方法获得的转基因小麦存在外缘基因的拷贝数多、再生困难和不育等缺陷。小麦转化技术已成为限制小麦基因工程研究发展的重要因素。由于这种限制，至今已获得的有经济应用价值的转基因小麦极其有限。在现有的小麦转化技术中，农杆菌介导的小麦遗传转化一直是国内外相关领域的热点和难点。1997年Monsanto公司的Cheng等在世界上首次报道了以小麦幼胚和胚性愈伤组织为外植体获得了农杆菌介导的转基因(npt II)再生植株，并提出了一套较为成熟的转化系统。1999年我国的夏光敏也报道了用农杆菌介导法将npt II基因导入小麦幼胚和胚性愈伤组织，得到转基因植株，转基因频率达到3.7-5.9%，明显高于其它小麦转化研究。但这些转化方法均需经过组织培养再生植株。已有的研究表明小麦不同基因型的受体材料对植株再生有显著影响。目前已知小麦幼胚和胚性愈伤组织的再生能力较高，但受基因型的限制很大，而我国多数生产用小麦当家品种，由愈伤组织分化再生非常困难，这限制了需经组织培养途径进行遗传转化技术的应用。2005年2月16日公开的公开号为1580257,名称为“ 一种培育转基因小麦的方法及其应用”的中国专利申请中，采用小麦生长点作为农杆菌介导的遗传转化的外植体，从根本上克服了小麦基因型对转化后形成可育再生植株的限制，获得了表达报告基因的转基因小麦，生长点转化率达到60-70%，成苗率平均90%，从而克服了小麦遗传转化的瓶颈问题-基因型的限制。上述技术的探索是一种适合于我国小麦的遗传转化方法，克服了当前小麦遗传转化中存在的瓶颈问题。然而，至今为止，通过上述技术转化到小麦中的基因多是报告基因，获得的有经济应用价值的转基因小麦却是少之又少。鉴于以上所述，本专利技术利用反转录-聚合酶链式反应从小麦中分离出三个同源基因TaTOC 1-A、TaTOC 1-B和TaTOCl-D，进一步构建RNAi的表达载体，利用农杆菌介导的遗传转化方法转化小麦CB037，并获得抽穗期提iu的转基因小麦。缩略语和关键 术语定义:TOCl =Timing Of CAB I( 一个与 CAB I 的定时有关的基因)；LHY:Late Elongated Hypocotyl( 一个能导致下胚轴晚延伸的基因)；CCAl:Circadian Clock Associated I ( 一个与昼夜节律钟相关的基因)；PRR:Pseudo-Response Regulators ( 一类非典型的响应调节因子)。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供小麦TaTOCl基因及其克隆方法和应用。采用如下技术方案:小麦TaTOCl 基因，包括 TaTOC 1-A、TaTOC 1-B、TaTOC 1-D，TaTOCl-A 核苷酸序列为SEQ ID NO:1 ;TaT0Cl-B 核苷酸序列为 SEQ ID NO:2 ;TaT0Cl_D 核苷酸序列为 SEQ ID NO:3。小麦TaTOCl基因的克隆方法，包括以下步骤:1)利用Trizol试剂盒提取总RNA ；2)第一条链的合成:取2yg总RNA，加入5X反应缓冲液4 μ 1，IOmM脱氧核糖核酸(dNTP)2y 1，核糖核酸酶抑制剂(40-200u/yl)0.5yU|*oligodT(lyg/yl)lyl，S转录酶(iou/μ 1)2μ 1，42°C反应60分钟，85°C放置10分钟终止反应，稀释至200 μ I ；3)PCR反应；4)基因克隆:取2μ I PCR产物与pMD18-T载体进行连接，操作步骤按pMD18-TVector说明书进行；然后连接产物转化大肠杆菌DH5 α菌株，在表面涂5_本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．小麦ＴａＴＯＣ１基因，其特征在于，包括ＴａＴＯＣ１－Ａ、ＴａＴＯＣ１－Ｂ、ＴａＴＯＣ１－Ｄ，ＴａＴＯＣ１－Ａ核苷酸序列为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１；ＴａＴＯＣ１－Ｂ核苷酸序列为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２；ＴａＴＯＣ１－Ｄ核苷酸序列为ＳＥＱ ＩＤＮＯ：３。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张宪省，赵翔宇，陈祥彬，叶兴国，潘衍有，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：37
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