一种培育转基因耐寒植物的方法技术

本发明专利技术公开了一种培育转基因耐寒植物的方法，首先构建含有SEQ?ID?NO：2所示基因的重组表达载体，然后利用此重组表达载体构建转化体，再利用此转化体侵染目的植物，筛选阳性植株，获得与正常植物相比具有高耐寒性的转基因植物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程
，尤其是。
技术介绍
大豆是世界上重要的蛋白和油料作物。低温对大豆生长造成严重影响，特别是在生长后期，冷胁迫往往对大豆产量造成严重破坏，成为限制大豆产量提高的重要因素。长期以来，人们主要用传统遗传育种的方法对大豆的抗逆性进行改良，然而这种方法具有效率低、周期性长的缺点，并且随着长期的使用其效果越来越不明显。利用转基因技术将抗逆相关基因转化到大豆中是提高大豆抗逆性的一个更直接有效的途径和必然趋势。目前，植物抗冷机制在拟南芥中研究较多，其中研究的最为清楚的是 CBFs (CRT-binding factorl)转录因子，包括CBFs的上下游发挥功能的各个基因所介导的冷信号通路(Jaglo-Ottosen et al.，1998 ；Gilmour et al.，2000)。另外，除了 CBFs 转录因子介导的冷信号通路外，其他独立于CBFs转录因子之外的冷信号通路的研究也取了一些进展(Zhu et al.，2004 ；Xin et al.，2007 ；Zhu et al.，2008)。大豆抗冷机理的研究相对较少，冷相关基因的克隆和功能研究相对滞后。目前，主要通过同源克隆的方法在大豆中克隆了一些冷相关的基因。这些基因主要包括一些Ap2、 bZIP、MYB、WRKY等家族的转录因子。Chen等通过同源搜索大豆EST数据库得到一个含有 Ap2结构域的基因GmDREB3，可以和干旱应答原件DRE结合，此基因受冷诱导上调，同时此基因转化拟南芥的过表达植株能增强对冷、干旱、盐等胁迫条件的抗性(Chen et al.，2008)。 Liao等以拟南芥bZIP结构域为探针对大豆EST序列搜索、拼接，最终鉴定了 4个bZIP家族的基因，其表达受到不同胁迫条件的调节，可以同ABRE元件结合并且其转化拟南芥的过表达植株增强了对冷冻和盐胁迫条件的抗性(Liao et al.，2008)。跑皿等通过同源比对的方法鉴定了数个含有WRKY结构域的基因，能同W-box作用元件结合，其表达受盐、干旱、 冷等胁迫条件的调节，其转基因过表达拟南芥植株对盐、干旱、冷等胁迫的抗性增加(aiou et al. ,2008). Cheng等利用cDNA-AFLP技术在大豆胚轴中得到一个受冷上调的基因，其过表达拟南芥植株增强了对冷、干旱和盐的抗性(Cheng et al.，2009)。Xie等利用RACE 技术得到2个trihelix家族的转录因子，其蛋白被定为在细胞核中表达，其过表达拟南芥植株增强了对冷、干旱和盐的抗性(Xie et al. ,2009) RCCl (regulator of chromosome condensation 1)家族蛋白是一种启动染色体集缩的负调节物，RCCl首先从小仓鼠的肾细胞系 BHK-21 中分离出来(Kai et al.，1986 ；Ohtsubo et al.，1987)。RCCl 是目前已知的 Ran鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)，通过调节Ran⑶P到RanGTP的转换，在核内输、外运、有丝分裂期纺锤体的形成及核膜重组、防止S期DNA多重复制等过程中起作用(Yamaguchi and Newport, 2003)。RCCl家族基因在生物中的保守性很高，在植物中，对RCCl家族基因的研究刚刚起步。Kliebenstein等在拟南芥中鉴定了一个RCCl家族基因UVR8，能增强拟南芥对紫外线的抗性，但UVR8不具有GEF活性(Kliebenstein et al. ,2002) Favory等研究表明在 UV-B 照射的条件下，UVR8 与 COPl (constitutively photomorphogenic 1)可以发生相互作用，调节UV-B引导的光形态建成，以减少UV-B对植物的损伤(Favory et al., 2009)。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供，将目的基因导入到正常植物体内高表达，获得与正常植物相比具有高耐寒性的转基因植物。为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案如下。，使序列表中SEQ ID NO 1所示蛋白质的编码基因在植物体内过表达，获得与正常植物相比具有高耐寒性的转基因植物。作为本专利技术的一种优选技术方案，使序列表中SEQ ID NO 2所示的基因在植物体内过表达，获得与正常植物相比具有高耐寒性的转基因植物。作为本专利技术的一种优选技术方案，首先构建含有SEQ ID NO :2所示基因的重组表达载体，然后利用此重组表达载体构建转化体，再利用此转化体侵染目的植物，筛选阳性植株，获得与正常植物相比具有高耐寒性的转基因植物。作为本专利技术的一种优选技术方案，以SUPER1300为载体构建重组表达载体。作为本专利技术的一种优选技术方案，将目的基因插入到SUPER1300的限制性内切酶 Xba I和Kpn I酶切识别位点之间，得到重组表达载体，命名为SUPER1300-35S_GmIC0。作为本专利技术的一种优选技术方案，以pES (K)LC为载体构建重组表达载体。作为本专利技术的一种优选技术方案，将目的基因插入到pESUK)LC的限制性内切酶Kpn I和BamH I酶切识别位点之间，得到重组表达载体，命名为pE^⑷ LC-35S-GFP-GmIC0o作为本专利技术的一种优选技术方案，利用重组表达载体转化农杆菌GV3101获得转化体，然后再利用农杆菌介导的蘸花法转化目的植物，筛选阳性植株，经过三代筛选得到纯合的与正常植物相比具有高耐寒性的转基因植物。作为本专利技术的一种优选技术方案，所述目的植物为大豆。采用上述技术方案所产生的有益效果在于本专利技术的基因在冷诱导的条件下高表达，通过基因工程技术将此基因转移到拟南芥中可以显著提高拟南芥对低温的抗性；低温胁迫环境下培育，野生型植株的成活率为42%，两个导入本专利技术基因的转基因株系的成活率分别为69%和74% ；转基因技术已经成为提高作物抗逆性的主要途径，本专利技术为提高大豆等作物的耐冷性提供了重要的基因资源。附图说明图1为大豆GmICO蛋白与人类RCCl蛋白功能结构域分析结果，图中着色圆球所示为RCCl重复结构域。图2为利用RT-PCR技术对GmICO表达模式分析的结果，图A-D为大豆中GmICO基因在受低温、ABA、NaCl、PEG胁迫下的RT-PCR电泳图谱；图E为不同组织——叶(L)、茎⑶、 根(R)、根瘤(N)、——中GmICO表达模式结果。图3为pCAMBIAl391-PemiarGUS的⑶S染色对GmICO表达模式的分析结果。图4为转基因拟南芥抗冷性表型鉴定结果，图A为PCR对转基因植株的鉴定结果，图B为野生型拟南芥和转基因拟南芥抗冷性表型比较。 具体实施例方式以下实施例详细说明了本专利技术。本专利技术所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验， 结果取平均值。本专利技术的基因及其编码的蛋白质，来源于大豆属大豆(Glycine max L.)，其名称为 GmICOo序列表中SEQ ID NO 1所示为GmICO蛋白的氨基酸序列，参看图1，GmICO蛋白为一种人类 RCCl (Regulator of chromosome condensation 1)蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种培育转基因耐寒植物的方法，其特征在于：使序列表中ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１所示蛋白质的编码基因在植物体内过表达，获得与正常植物相比具有高耐寒性的转基因植物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李霞，董章辉，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：13