一种开源方式筛选靶向结合人DYRK1A基因靶位点的锌指蛋白的方法技术

本发明专利技术一种开源方式筛选靶向结合人DYRK1A基因靶位点的锌指蛋白的方法，属于基因工程技术领域。该方法包括：(1)3个锌指蛋白库的构建；(2)报告载体和报告菌株的构建；(3)有效锌指库的筛选；(4)有效锌指库的连接、组装；(5)利用细菌双杂交原理筛选出具有较高特异性和亲和力的三锌指蛋白。本发明专利技术所述的方法具有获得的锌指蛋白特异性和亲和性较高，组装的锌指核酸酶有更高的效率的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种开源方式筛选靶向结合人DYRKlA 基因靶位点的锌指蛋白的方法。
技术介绍
锌指核酸酶技术是新近发展起来的一种可用于基因功能分析、动植物转基因研究以及基因治疗等领域的新兴技术。人工锌指核酸酶(Zinc fingernuclease, ZFN)是由锌指蛋白(Zinc finger protein, ZFP)与非特异核酸酶结合的人工合成酶，此酶的N末端为锌指蛋白DNA结合域，能识别含有特定碱基序列的DNA序列，并结合在此位点；C末端是为非特异性核酸酶I^ok I结构域。ZFN能识别一段特异的DNA序列，设计好的两个互补的 ZFN分子以二聚体的形式同时特异性结合到目标DNA上，并在中间的5 7bp处切割，产生一个双链切口(Double strand break，DSB)，然后利用细胞固有的同源重组(Homologous recombination, HR)或非同源末端连接(Non-homologousend-joining，NHEJ)修复机制将切口修复，从而达到精确定点修饰和改造致病基因的目的，不仅将基因组靶向修饰的效率提高了 3 5个数量级，而且具有极高的特异性。人工锌指蛋白由若干锌指域组成，每个锌指单位约含30氨基酸残基，当&ι2+存在时折叠形成紧密的β-β-α结构，其中Si2+夹叠在α螺旋和两股反向平行的β折叠中， 与β折叠末端的2个半胱氨酸和α螺旋C末端的2个组氨酸形成四面体结构.单个锌指的α螺旋插入DNA双螺旋的大沟，其-1、2、3、6位置上的氨基酸残基可识别并结合DNA序列上3个连续碱基(Triplet)，而骨架结构保守。改变α螺旋上这几个位点的氨基酸残基， 锌指识别位点的碱基也会改变，从而可增加锌指识别特异位点的多态性.如果把α螺旋-1 至6位置上的7个关键氨基酸完全随机化，可得到一个锌指库，该库理论上可识别任意一个三联碱基。特异识别并结合靶向DNA序列的锌指蛋白筛选是锌指核酸酶技术的核心，也是该技术的重点和难点.目前有模块式(Modular Assembly)和开源式两种方法组装或筛选特异性锌指蛋白.模块式方法不考虑锌指间的相互作用，将识别靶位点上三联碱基的若干单锌指直接依次连接组装，获得的锌指蛋白特异性较低；而开源式方法则更多地考虑多个锌指间的协同作用，将识别靶位点上各三联碱基的锌指库依次连接组装，再利用细菌双杂交系统筛选出与靶位点识别并结合的锌指蛋白，该方法获得的锌指蛋白特异性和亲和性较高，组装成的锌指核酸酶成功率更高。Maeder等拥有识别所有三联碱基GNN和部分TNN的锌指库。每个识别特定三联碱基的锌指库至多含有95个锌指。该锌指库库容有限，不能对ANN或CNN等三联碱基筛选， 并且没有这些锌指库的实验室也无法实现筛选。
技术实现思路
5本专利技术的目的是为了解决现有锌指库的不足，提供了一种开源方式筛选靶向结合人DYRKlA基因靶位点的锌指蛋白的方法，该锌指蛋白是三锌指蛋白即由三个锌指域(三个锌指单位)组成的锌指蛋白。本专利技术的技术方案如下一种开源方式筛选靶向结合人DYRKlA基因靶位点的锌指蛋白的方法，包含下述步骤(1)、3个锌指蛋白库的构建分别以已知的由ZF1、ZF2和ZF3组成的三锌指序列为模板，构建3个锌指蛋白库，其中每个锌指蛋白库中保持三锌指序列中的两个锌指序列不变，只将其中一个锌指序列的α螺旋中编码7个氨基酸的21碱基完全随机化，得到该锌指域随机的锌指蛋白库ZFP1、ZFP2和ZFP3，其中ZFPl库中所有序列保持ZF2和ZF3不变， 仅ZFl为随机序列；ZFP2库中所有序列保持ZFl和ZF3不变，仅ZF2为随机序列；ZFP3库中所有序列保持ZFl和ZF2不变，仅ZF3为随机序列；(2)、报告载体和报告菌株的构建以阳性报告载体PBAC-BA-IacZ为底物，构建碱基序列片段，其中在该碱基序列片段中的原阳性报告载体相应位置上的三联碱基被作为引物的锌指序列识别的三联碱基代替；将所述碱基序列片段与阴性报告载体PBAC-IacZ 骨架连接，得到报告载体；把所得到的报告载体分别转化到感受态细胞KJBAC中，所得单克隆即为含有识别不同靶位点的报告菌株，所述报告菌株分别为pBAC-RZFBS3-lacZ、 pBAC-RZFBS2-lacZ、 pBAC-RZFBS卜lacZ、 pBAC_RZFBS_lacZ、 pBAC_LZFBSl_lacZ、 pBAC-LZFBS2-lacZ、pBAC_LZFBS3_lacZ、pBAC-LZFBS-lacZ ；(3)、有效锌指库的筛选分别取步骤⑴中得到的锌指蛋白库和质粒PGal 4-Kan 同时电转化到步骤( 所得的报告菌株中，筛选得到有效锌指库；0)、有效锌指库的连接、组装以步骤C3)筛选得到的同为一侧的有效锌指库为底物，用重叠PCR的方法将同侧的三个有效锌指库，分别扩增并连接起来，构建成识别整个右边靶位点的锌指蛋白库RF和左边靶位点的锌指蛋白库LF ；(5)、利用细菌双杂交原理筛选出具有较高特异性和亲和力的三锌指蛋白取步骤⑷中得到的锌指蛋白库RF和质粒pGal 4-Kan共转化到步骤⑵所得的报告菌株 pBAC-RZFBS-lacZ中，挑取深蓝色菌落，提取酶活较高菌落质粒，即为结合右半边靶位点的锌指蛋白；取步骤(4)中得到的锌指蛋白库LF和质粒pGal 4-Kan共转化到步骤( 所得的报告菌株pBAC-LZFBS-lacZ中，挑取深蓝色菌落，提取酶活较高菌落质粒，即为结合左半边靶位点的锌指蛋白。上述技术方案中所述的开源方式筛选靶向结合人DYRKlA基因靶位点的锌指蛋白的方法，其中，所述步骤(1)中锌指蛋白库ZFP1、ZFP3和ZFP2的构建包括下述步骤(1) ZFl随机的ZFPl片段、ZF3随机的ZFP3片段和ZF2随机的ZFP2片段的构建， 其中ZFl随机的ZFPl片段是通过以锌指蛋白表达质粒pGP-FB-orig BA为底物，ZFl-F和 ZFR为引物，进行PCR反应扩增；然后以此PCR反应产物为底物，以ZFF和ZFR引物，进行PCR 反应扩增，得到ZFl随机的ZFPl片段；ZF3随机的ZFP3片段是通过以锌指蛋白表达质粒pGP-FB-orig BA为底物，ZFF和 ZF3-R为引物，进行PCR反应扩增；然后以此PCR产物为底物，以ZFF和ZFR为引物，进行PCR 反应扩增，扩增完整的锌指蛋白表达片段，即得即ZF3随机的ZFP3片段；ZF2随机的ZFP2片段是通过以以锌指蛋白表达质粒pGP-FB-orig BA为底物，ZFF 和ZF2-Up为引物，进行PCR反应扩增三锌指片段上半部分；以pGP-FB-orig BA为底物， ZF2-F和ZFR为引物，扩增该片段的后半部分，将ZF2中的21个关键碱基随机化，然后将这两部分PCR产物等量混合，以ZFF和ZFR为引物，扩增全长片段，获得ZF2随机的ZFP2片段；(2)将ZFPl片段、ZFP3片段和ZFP2片段分别与表达载体pGP_FF骨架连接；连接产物电转化到电转化感受态细胞JM109中，单克隆产物经培养后收集，提取质粒，获得ZFl 随机的ZFPl库、ZF3随机的ZFP3库和ZF2随机的ZFP2库。上述技术方案中所述的开源方式筛选靶向结合人DYRKl本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种开源方式筛选靶向结合人ＤＹＲＫ１Ａ基因靶位点的锌指蛋白的方法，包含下述步骤：（１）、３个锌指蛋白库的构建：分别以已知的由ＺＦ１、ＺＦ２和ＺＦ３组成的三锌指序列为模板，构建３个锌指蛋白库，其中每个锌指蛋白库中保持三锌指序列中的两个锌指序列不变，只将其中一个锌指序列的α螺旋中编码７个氨基酸的２１碱基完全随机化，得到该锌指域随机的锌指蛋白库ＺＦＰ１、ＺＦＰ２和ＺＦＰ３，其中ＺＦＰ１库中所有序列保持ＺＦ２和ＺＦ３不变，仅ＺＦ１为随机序列；ＺＦＰ２库中所有序列保持ＺＦ１和ＺＦ３不变，仅ＺＦ２为随机序列；ＺＦＰ３库中所有序列保持ＺＦ１和ＺＦ２不变，仅ＺＦ３为随机序列；（２）、报告载体和报告菌株的构建：以阳性报告载体ｐＢＡＣ－ＢＡ－ｌａｃＺ为底物，构建碱基序列片段，其中在该碱基序列片段中的原阳性报告载体相应位置上的三联碱基被作为引物的锌指序列识别的三联碱基代替；将所述碱基序列片段与阴性报告载体ｐＢＡＣ－ｌａｃＺ骨架连接，得到报告载体；把所得到的报告载体分别转化到感受态细胞ＫＪＢＡＣ中，所得单克隆即为含有识别不同靶位点的报告菌株，所述报告菌株分别为ｐＢＡＣ－ＲＺＦＢＳ３－ｌａｃＺ、ｐＢＡＣ－ＲＺＦＢＳ２－ｌａｃＺ、ｐＢＡＣ－ＲＺＦＢＳ１－ｌａｃＺ、ｐＢＡＣ－ＲＺＦＢＳ－ｌａｃＺ、ｐＢＡＣ－ＬＺＦＢＳ１－ｌａｃＺ、ｐＢＡＣ－ＬＺＦＢＳ２－ｌａｃＺ、ｐＢＡＣ－ＬＺＦＢＳ３－ｌａｃＺ、ｐＢＡＣ－ＬＺＦＢＳ－ｌａｃＺ；（３）、有效锌指库的筛选：分别取步骤（１）中得到的锌指蛋白库和质粒ｐＧａｌ　４－Ｋａｎ同时电转化到步骤（２）所得的报告菌株中，筛选得到有效锌指库；（４）、有效锌指库的连接、组装：以步骤（３）筛选得到的同为一侧的有效锌指库为底物，用重叠ＰＣＲ的方法将同侧的三个有效锌指库，分别扩增并连接起来，构建成识别整个右边靶位点的锌指蛋白库ＲＦ和左边靶位点的锌指蛋白库ＬＦ；（５）、利用细菌双杂交原理筛选出具有较高特异性和亲和力的三锌指蛋白：取步骤（４）中得到的锌指蛋白库ＲＦ和质粒ｐＧａｌ　４－Ｋａｎ共转化到步骤（２）所得的报告菌株ｐＢＡＣ－ＲＺＦＢＳ－ｌａｃＺ中，挑取深蓝色菌落，提取酶活较高菌落质粒，即为结合右半边靶位点的锌指蛋白；取步骤（４）中得到的锌指蛋白库ＬＦ和质粒ｐＧａｌ　４－Ｋａｎ共转化到步骤（２）所得的报告菌株ｐＢＡＣ－ＬＺＦＢＳ－ｌａｃＺ中，挑取深蓝色菌落，提取酶活较高菌落质粒，即为结合左半边靶位点的锌指蛋白。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张智英，李战伟，杨涵江，任刚，王令，张存芳，张婷婷，王瑞，贾杰只，雷洁，李亚明，支旭勃，韩新艳，辛颖，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：61