大白菜核不育复等位基因Ms的SCAR标记及应用制造技术

本发明专利技术提供了位于大白菜核不育复等位基因Ms两侧，并与其紧密连锁的两个SCAR 标记，SCR01-378和SCR02-208。这两个标记与Ms基因之间的遗传距离分别为1.2cM和 2.5cM。根据二者的核苷酸序列分别设计了两对特异扩增引物，用于大白菜核不育复等位 基因的分子辅助选择。在辅助选择过程中同时使用这两个标记，选择准确度为97.5％以上。 这两个标记重复性好，可靠性高，检测成本低，省时省力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及与大白菜核不育复等位基因Afe紧密连锁的特征序列扩增(Sequence Characterized Amplified Region, SCAR )标记及其获得方法。
技术介绍
1991年，本课题组获得了4份具有100%不育株率的雄性不育材料，研究发现该不育材 料的不育性属于复等位基因遗传，随后提出了大白菜核基因雄性不育复等位基因遗传假 说，并为后来的实验所证实。研究表明，此不育性由一个位点3个基因控制M^为显 性不育基因；ms为Ms的等位隐性可育基因；M/为My的等位显性恢复基因，三者 之间的显隐关系为M/〉M^m^。配成不育系的两用系不育株基因型为MsM ，可育株 为M/M^。临时保持系基因型为船ms。用两用系不育株(MyMy)与临时保持系 (wwto )交配，可以获得具有100%不育株率的雄性不育系(il^Msxmsws—Mww)。由于该类不育材料特殊的遗传机制，在不育系转育过程中，每代都需要采用测交的方 法鉴定中间材料的基因型，等到下一代开花后，才能获知上一代选定材料的基因型，这样 势必影响转育进程，因此新不育系转育难的问题还没有彻底解决。分子标记辅助选择技术 (MAS)可能是最终解决这一问题的有效途径。目前，只有国内沈阳农业大学冯辉等(2009)获得了两个与大白菜核不育复等位基因 My连锁的SSR标记。但这两个标记位于目标基因的同一侧，遗传距离较远，且检测方法复 杂，因此无法应用于分子标记辅助育种当中。而SCAR标记具有稳定、廉价、方法简便等 优点。目前已有大量SCAR标记应用在辅助选择当中。因此，我们有必要开发与大白菜核 不育复等位基因Ms紧密连锁的SCAR标记，从而简化具有100%雄性不育株率的大白菜雄 性不育系的转育程序。
技术实现思路
本专利技术目的是(1)提供大白菜核不育复等位基因V^的两个SCAR标记；(2) 提供由所述SCAR标记的PCR引物序列；(3) 提供在对大白菜核不育复等位基因进行辅助选择的过程中对上述SCAR标记进行应用的方法。本专利技术的技术方案是1.位于大白菜核不育复等位基因Afe两侧，并与其紧密连锁的SCAR标记SCR(H-378与 SCRo2-208分别具有如下核苷酸序列 (1) SCR。i-378:TGAGGTTCTCCCTCCAGCTTTGGGAAGTAATGTGGTGGAA-3' (2) SCRq2-208TGTGGTTGGAGACTCAGACATACGCCACTATTGATG-3，2. 上述SCAR标记SCRor378与SCRo2-208的特异性扩增引物分别具有如下序列(1) SCRo广378:FSCRm: 5'-GCAAATTTGTCAAACTTCACC -3， SSCRoi: 5' -TCCACCACATTACTTCCCAA-3'(2) SCRo2-208FSCR02: 5，-AGGATATATCTTGGCTCACGAG-3' RSCRo2: 5 ，-CATCAATAGTGGCGTATGTCTG-3'3. 上述SCAR标记SCRoi-378与SCRo2-208在辅助选择中的应用方法为(1) 用CTAB法对待测材料进行基因组DNA的提取(2) PCR扩增a.反应体系25uL体系，各组分物质的含量分别为20ng template; 2.5uL 10xBuffer;1.6mM MgCl2; 0.15mmol/L dNTP; 5pmo1 primer; 1.25U Tag DNA polymerase; ddH20补齐 25uL，混匀，离心；b.扩增程序预变性94。C/4min， 94°C/60s、 59°C/60s、 72°C/90s， 30个循环后，72°C 延伸10min;C.电^C:① SCRoi-378:取10uL扩增产物与2uL的6xLoadingbuffer混匀，点入含有0.5ug/ml EB 的1.5%琼脂糖凝胶中，在110V电压下电泳lh，经EB染色后在凝胶成像仪中观察拍照。② SCRo2-208:将选择性扩增产物与等体积的上样缓冲液混合(98% formamide, 10 mM EDTA, 0.001% xylene cyanol禾口bromphenol blue)。 94。C变性5min，之后在DNA测序电 泳仪上进行变性聚丙烯酰胺凝胶(6%)电泳，85W条件下电泳3小时。电泳结束后，使用 由Bioneer公司生产的银染试剂盒进行银染。d.判断① 在使用SCR(u-378的引物的扩增结果中检测到378bp条带，则该材料带有大白菜核 不育复等位基因My的概率为98.8n/o;② 在使用SCRo2-208的引物的扩增结果中检测到两条带(208bp和204bp)，则该材料 带有大白菜核不育复等位基因Ms的概率为97.5M。◎如果①、②两项中的扩增结果均可获得，则待测材料具有大白菜核不育复等位基 因My的概率为100。/。。 三、有益效果上述SCAR标记SCR(u-378与SCRo2-208距离大白菜核不育复等位基因Ms的遗传距离 分别为L2cM和2.5cM，可广泛应用于大白菜核不育复等位基因Ms的分子标记辅助选择育 种。本专利技术通过特异引物PCR扩增可对待测植株进行苗期鉴定，大大提高了育种效率，縮 短了育种进程。 附图说明图l: SCRor378在亲本及部分Bd代个体上的扩增结果 图2: SCRo2-208在亲本及部分Bd代个体上的扩增结果 图l、 2中符号分别表示为 Pf:可育亲本S02;Ps:不育亲本AB01-1;Bf: Bd代群体中可育单株； Bs: Bd代群体中不育单株；*: Bd代群体中在大白菜核不育复等位基因位点和SCAR标记间发生交换的单株；M: DL2000 DNA ladder 具体实施例方式实施例l、与大白菜核不育复等位基因M5连锁的扩增片段长度多态(AFLP)标记的获得一、 分离群体的构建以AB01-1 (MsMs)作为母本与S02 (msms)杂交，所获Fi代植株全部表现为不育。 之后以S02为轮回亲本，构建Bd代分离群体。在播种的全部244株Bd代个体中，130株为 可育，114株表现为不育。育性分离比例符合复等位基因遗传的1:1(5C^0.922;A.。5，产3.84)。二、 DNA的提取a. 在1.5ml离心管中加入500uL 1XCTAB提取液(2% CTAB, 10Ommol/L Tris-HCl， 20mmol/LEDTA， 1.4mol/LNaCl，)以及6uL P-巯基乙醇，摇匀；b. 取0.2g幼嫩叶片，在液氮条件下研磨至粉末，加入到含有CTAB提取液和e-巯基乙醇 的离心管中，摇匀；c. 随后将离心管放入65'C水浴中，每隔5分钟摇一次，水浴30min;d. 取出离心管，加入等体积的酚:氯仿:异戊醇混合物(25:24:1)，摇晃10min后，常温下 12000r/min离心10min;e. 将上清液转移到另一离心管中，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1),摇晃10min后，常 温下12000r/min离心1 Omin;f. 将上清液移至另一离心管当中，加入2倍体积事先预冷的无水乙醇，混匀后，将抱团的 DNA挑入到装有400uLTE缓冲液的离心管中溶解；g. 加入1.5uLRNas本文档来自技高网...

【技术保护点】
位于大白菜核不育复等位基因Ｍｓ两侧，并与其紧密连锁的ＳＣＡＲ标记ＳＣＲ↓［０１］－３７８与ＳＣＲ↓［０２］－２０８，其特征在于，这两个ＳＣＡＲ标记分别具有如下核苷酸序列：　（１）ＳＣＲ↓［０１］－３７８：　５’－ＧＣＡＡＡＴＴＴＧＴＣＡＡＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＴＧＴＡＣＧＧＡＡＡＡＡＴＧＴＴＴＧＣＧＧＣＴＴＧＡＣＧＴＧＧＣＴＣＧＡＧＴＴＴＣＴＣＣＡＧＡＡＧＣＣＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＡＧＧＡＴＣＡＧＣＴＴＣＧＣＧＧＡＴＡＡＧＧＡＴＧＧＴＧＴＧＣＡＡＧＴＧＧＴＧＡＴＴＧＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＣＣＣＣＴＧＧＴＴＧＣＣＴＣＣＧＡＧＡＴＧＣＡＡＴＡＴＴＴＧＣＡＡＴＧＣＴＴＧＧＧＧＣＣＡＣＡＡＧＧＧＡＧＡＧＧＣＡＴＧＴＡＡＴＴＣＧＡＧＧＡＡＧＡＴＴＡＡＧＧＴＴＣＴＧＣＡＡＡＡＧＧＡＣＡＡＧＧＡＧＡＴＡＧＴＡＧＴＡＧＴＧＧＣＣＣＣＧＧＡＡＧＴＴＧＡＧＡＴＴＡＡＣＧＧＴＧＡＴＧＧＧＣＡＧＧＴＧＡＧＧＴＡＴＧＣＧＡＴＣＡＣＣＣＣＡＡＡＣＣＧＡＡＡＴＧＴＴＧＴＴＡＧＴＧＡＴＴＴＧＣＴＣＣＡＣＧＡＧＣＴＴＧＡＧＧＴＴＣＴＣＣＣＴＣＣＡＧＣＴＴＴＧＧＧＡＡＧＴＡＡＴＧＴＧＧＴＧＧＡＡ－３’　（２）ＳＣＲ↓［０２］－２０８　５’－ＡＧＧＡＴＡＴＡＴＣＴＴＧＧＣＴＣＡＣＧＡＧＡＴＧＡＴＧＣＡＴＧＣＴＴＡＴＣＴＴＡＧＡＣＴＣＡＡＴＧＧＴＡＣＧＴＡＴＴＧＧＡＴＴＡＴＴＴＧＡＴＣＡＴＣＡＣＴＣＴＧＡＧＧＧＡＧＡＧＧＴＣＴＣＴＣＡＡＧＴＧＴＧＴＴＴＴＧＧＴＴＡＣＡＧＧＡＴＧＴＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＣＡＣＣＧＴＴＡＴＧＧＡＡＧＡＡＧＧＡＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＧＣＴＡＧＧＣＣＡＣＡＴＧＴＧＧＴＴＧＧＡＧＡＣＴＣＡＧＡＣＡＴＡＣＧＣＣＡＣＴＡＴＴＧＡＴＧ－３’...

【技术特征摘要】
1.位于大白菜核不育复等位基因Ms两侧，并与其紧密连锁的SCAR标记SCR01-378与SCR02-208，其特征在于，这两个SCAR标记分别具有如下核苷酸序列(1)SCR01-3785’-GCAAATTTGTCAAACTTCACCCTTGTACGGAAAAATGTTTGCGGCTTGACGTGGCTCGAGTTTCTCCAGAAGCCACTGGTGGAGAGGATCAGCTTCGCGGATAAGGATGGTGTGCAAGTGGTGATTGATGTATGCTACCCCTGGTTGCCTCCGAGATGCAATATTTGCAATGCTTGGGGCCACAAGGGAGAGGCATGTAATTCGAGGAAGATTAAGGTTCTGCAAAAGGACAAGGAGATAGTAGTAGTGGCCCCGGAAGTTGAGATTAACGGTGATGGGCAGGTGAGGTATGCGATCACCCCAAACCGAAATGTTGTTAGTGATTTGCTCCACGAGCTTGAGGTTCTCCCTCCAGCTTTGGGAAGTAATGTGGTGGAA-3’(2)SCR02-2085’-AGGATATATCTTGGCTCACGAGATGATGCATGCTTATCTTAGACTCAATGGTACGTATTGGATTATTTGATCATCACTCTGAGGGAGAGGTCTCTCAAGTGTGTTTTGGTTACAGGATGTAGGAATCTGAACACCGTTATGGAAGAAGGAATATGCCAAGTGCTAGGCCACATGTGGTTGGAGACTCAGACATACGCCACTATTGATG-3’2. 根据权利要求l所述的位于大白菜核不育复等位基因Ms两侧，并与其紧密连锁的 SCAR标记SCRoi-378与SCRo2-208的PCR特异性扩增引物，其特征在于，两对特异性扩增 引物分别具有如下序列(1) SCRoi-378:FSCR。i: 5'-GCAAATTTGTCAAACTTCACC -3' SSCRoi: 5' -TCCACCACATTACTTCCCAA -3'(2) SCR...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯辉，魏鹏，朴钟云，刘志勇，李承彧，王玉刚，冀瑞琴，纪淑娟，
申请(专利权)人：冯辉，魏鹏，朴钟云，刘志勇，李承彧，王玉刚，冀瑞琴，纪淑娟，
类型：发明
国别省市：89