本发明专利技术属于生物技术领域，涉及棉花恢复系纯度的分子鉴定方法，具体提供了用于鉴定含哈克尼西棉不育胞质的棉花恢复系的SSR标记的引物，其为核苷酸序列如SEQ?ID?No.1和2所示的引物和/或SEQ?ID?No.3和4所示的引物。本发明专利技术采用SSR标记对含哈克尼西棉细胞质雄性不育胞质的棉花恢复系材料进行了分子水平的多态性检测。该方法鉴定速度快、准确率高、操作简单，非常适用于棉花恢复系的室内鉴定和分子标记辅助选择育种。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及ー种棉花恢复系纯度鉴定和分子标记辅助育种的分子鉴定方法。
技术介绍
杂种优势的研究和利用对提高棉花的产量、改进品质、提高抗性具有显著效果。目前，我国育苗移栽地区的大部分棉农都已经栽种杂交棉；而且黄河流域棉区，甚至新疆等直播棉区也正在大力发展杂交棉。然而，棉花杂交种子的生产方式主要是人工去雄辅助授粉杂交制种法(占90%以上)。随着棉花主要生产区及其周边地区劳动カ成本逐年提高，种子生产成本已经越来越高，从而大大限制了杂交棉的进ー步大規模推广利用。与人工去雄辅助授粉杂交制种方式相比，利用“三系法”进行制种具有程序简便，成本仅为人工去雄杂交的30-40%，种子纯度高，适合大面积制种等独特优势。因而，三系杂交棉花的大面积推广，对于提高植棉效益，増加棉农收益，稳定棉花种植面积都具有重要的意义。目前，以哈克尼西棉细胞质雄性不育材料为基础的三系配套材料已经在我国得到成功应用，并已经在生产上开始应用。但是，与人工制种相比，可用的亲本资源仍然很少，特别是具有强恢复力的优良恢复系材料仍然是三系杂交棉选育的主要限制因素。因此，在三系杂交棉选育过程中，具有强恢复力的优良恢复系选育和改良一直是研究的重点和难点。而采用常规育种技术选育和改良新恢复系材料需要年限长，且每年转育后都需要进行大量的田间测交和鉴定工作，以确保恢复基因在转育和改良过程中没有丢失，从而需要耗费大量的棉田、人力和财力。因此，通过分子标记辅助选择如何稳定可靠又快速简便的进行恢复系选育和改良成为本专利技术的关键核心。分子标记直接从DNA水平反映出核苷酸序列的差异，它不受发育阶段、环境因素以及基因是否表达的影响，具有数量非常丰富，遗传稳定等特点。目前，随着分子生物学的飞速发展，分子标记检测技术已经发展出几十种技术可用于分子标记的筛选，比较常用的有RFLP、RAPD、ISSR、SSR、SCAR、STS、AFLP和SNP等，随着分子标记技术的不断发展和应用，目前，国内外已经越来越多的将各种分子标记技术应用在作物育种材料的分子标记辅助选择育种中。SSR(simple sequence repeat)也称为微卫星,是由基因组中1-6个核苷酸组成的基本単位重复多次构成的一段DNA。在所有真核生物基因组中均存在并且含量非常丰富，不仅存在于内含子中，也可以存在于编码区以及染色体的其它任何区域，具有多态性丰富、稳定性好、位点专ー性、共显性等特点。该方法对于目的基因具有很好的辅助选择效果，已成为分子标记在育种实践中直接应用的首选方法。在棉花中目前已开发的SSR引物已经超过一万对。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决现有技术中含哈克尼西棉细胞质雄性不育胞质的棉花恢复系选育田间鉴定检测方法所需时间长，消耗大、准确性差等的问题，提供ー种含，从而可以加快恢复系选育和改良进程，同时保证恢复系种子纯度。为了实现上述的目的，本专利技术以含恢复基因的近等基因系群体和F2群体为材料，通过对7256对SSR引物的筛选，从中筛选到得到两对可以用于检测恢复基因及位点是否纯合的SSR引物C0T010 引物对正向引物5，-TCACGCTTATACCTACAATGC-3，(SEQ ID No. I)反向引物5’ -TTGGGATGAGGCTGAAC-3’ (SEQ ID No. 2) CGR5340 引物对正向引物5’ -GGTGAACCAGTCGGAGATTT-3’ (SEQ ID No. 3)反向引物5’ -AGGCCACCGATCTTCACTC-3’ (SEQ ID No. 4)本专利技术还提供用于鉴定含哈克尼西棉不育胞质的棉花恢复系的SSR标记，其为用SEQ ID No. I和2所示的引物扩增出的250bp处的特异性条带和/或SEQ ID No. 3和4所示的引物扩增出的370bp处的特异性条带。本专利技术的另ー个目的在于提供用所述的标记或引物在鉴定棉花恢复系纯度或新恢复系选育中的应用。本专利技术的还ー个目的在于提供用所述的标记或引物在鉴定含哈克尼西棉不育胞质的棉花恢复系中的应用。在本专利技术ー个优选的实施方案中，用所述的SSR引物扩增待测棉花样本的基因组DNA，筛选出与恢复系具有相同特异性条带或带型的棉花样本；用上述SSR标记的引物扩增步骤I)筛选出的具特异性条带的棉花样本的基因组DNA，能扩增出与恢复系具有相同特异性条带的即为含哈克尼西棉不育胞质的棉花恢复系材料。本专利技术采用SSR标记对含哈克尼西棉细胞质雄性不育胞质的棉花恢复系材料进行了分子水平的多态性检测，从本研究的结果中可以看出，两标记鉴定的结果条带清晰、稳定、可靠，因此该方法非常适用于含哈克尼西棉细胞质雄性不育胞质的棉花恢复系材料真实性的室内鉴定和新恢复系材料的分子标记辅助选育。本专利技术与现有技术相比，有益效果为I)速度快SSR标记鉴定对辅助选育哈克尼西棉细胞质雄性不育胞质的棉花恢复系选育和保证恢复系种子纯度具有重要作用。棉花三系杂交种制种过程中，如果发生恢复系混杂将在杂交后代中产生不育棉株，从而对棉花产量造成重大影响，并严重影响棉农受益。此外，常规恢复系的选育过程涉及大量的测交等试验，并且需要调查大量的外部性状，需要投入大量的时间、人力和物力，且易受环境因素影响，因此，常规手段并不能完全准确、真实地反映恢复系的遗传情況。本专利技术只需提供棉花材料的种子或叶片，提取DNA后，用SSR引物对进行分子标记鉴定，利用相应分子鉴定体系可以很快地鉴定出恢复系种子的真实性，同时利用本专利技术可以在恢复系分子标记辅助选择过程中可以有效跟踪恢复基因的存在与否并通过共显性带型能很快鉴定恢复基因位点是否纯合，从而极大加快恢复系选育和改良过程。2)准确率高SSR标记具有简单、稳定可靠、重复性好等优点，很容易通过PCR快速扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。本专利技术利用两对SSR引物对恢复系进行鉴定，増加了鉴定的可靠性，且分子鉴定不受环境因素的影响，真正从DNA水平上鉴定恢复系的遗传情況，提高了准确性。3)实用简单本专利技术鉴定哈克尼西棉细胞质雄性不育胞质的棉花恢复系真实性和分子标记辅助选择育种的整个程序只是几次机械式的加样过程，易于操作，具有很好的商业化应用前景。 总之，本专利技术提供的SSR标记及其引物能够快速鉴定哈克尼西棉细胞质雄性不育胞质的棉花恢复系，其鉴定方法简单实用，其鉴定结果准确可靠，所以本专利技术提供的SSR标记及其引物能够快速有效的辅助棉花育种，对推动育种进程起了决定性的作用。附图说明图I为本专利技术棉花细胞质雄性不育恢复系和其它常规亲本SSR分析。其中，M marker, 1-6分别为恢复系中恢46，恢复系中恢80，常规棉品种中棉所12、中棉所41、中棉所45和中棉所69。其中两个恢复系亲本以marker为标准的250bp(A，以C0T010引物对(SEQID No. I和2)进行扩增)和370bp (B,以CGR5340引物对(SEQ ID No. 3和4)进行扩增)位置能检测到与恢复系相关的特异性条带(图中箭头所示位置)。图2为本专利技术以C0T010引物对对140份种子DNA进行扩增的結果。其中，图2A，1-50，中恢 46 ;图 2B, 51-100,中恢 80 ;图 2C，101-110，中棉所 12 ;图 2C，111-120，中棉所41 ;图 2C，121-本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邢朝柱，吴建勇，郭立平，戚廷香，
申请(专利权)人：中国农业科学院棉花研究所，
类型：发明
国别省市：
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