本发明专利技术涉及突变CyaA/E570Q+K860多肽，其适合用作蛋白质载体将一种或更多种受关注的分子递送到细胞，特别是表达CD11b受体的细胞中。本发明专利技术还涉及适合引发宿主中的免疫应答的多肽衍生物。本发明专利技术更具体而言涉及得自毒素或类毒素形式下的腺苷酸环化酶蛋白质(CyaA)的多肽，其为突变多肽。所述突变多肽能够保留天然CyaA与靶细胞的结合活性，且优选还能够保留天然CyaA经过其N-端结构域进入靶细胞中的易位活性，并且此外其具有成孔活性，该成孔活性与天然CyaA毒素的成孔活性相比是降低的或受抑制的。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及适合用于将一种或更多种分子递送到细胞中的多肽。具体而言，本专利技术涉及适合用于将一种或更多种能够引发免疫应答的分子，特别是通过表达⑶lib/⑶18受体的靶向细胞(在本文也称为“⑶lib表达细胞”)递送到宿主中的多肽。本专利技术更具体而言涉及得自腺苷酸环化酶蛋白质(CyaA)的多肽，腺苷酸环化酶蛋白质以毒素或解毒蛋白质或类毒素形式使用，所述多肽为突变多肽。所述突变多肽能够保留天然CyaA与靶细胞的结合活性，且优选还能够保留天然CyaA经过其N-端结构域进入靶细胞中的易位活性，并且此外其具有成孔活性，该成孔活性与天然CyaA毒素的成孔活性相比是降低的或抑制的。本专利技术特别涉及所述多肽作为蛋白质载体的应用。因此，所述突变多肽进一步与非-CyaA分子结合，从而产生多肽衍生物，其中所述分子当施用给宿主时具有预防性疫苗和/或治疗益处。本专利技术的多肽适合用作蛋白质载体，用于将分子，尤其是具有含一个或更多个表位特别是抗原的氨基酸序列的多肽分子递送到细胞中，特别是CDllb表达细胞中。本专利技术因此还涉及多肽衍生物(本专利技术的突变多肽的衍生物)，其包含本专利技术的突变多肽或由本专利技术的突变多肽组成，其中所述突变多肽与一个或更多个分子，尤其是一个或更多个适合引发免疫应答的分子重组，从而构成重组多肽或融合多肽。本专利技术还涉及通过使所述分子与突变多肽化学接枝而获得的多肽衍生物。根据一个实施方式，本专利技术的多肽衍生物适合用在预防疗法中，并且特别适合疫苗接种以及包括免疫疗法的治疗中，特别是用于在受试对象中引发免疫应答。在本专利技术的上下文中使用的用于设计本专利技术多肽的天然CyaA是主要在博德特氏菌属(Bordetella)生物中，特别是在百日咳博德特氏菌(Bordetella Pertussis)中产生的腺苷酸环化酶，其具有下述特征和性质，其公开的目的是在本专利技术的上下文中表征所述蛋白质。双功能RTX腺苷酸环化酶毒素-溶血素(于此也称为腺苷酸环化酶毒素(CyaA、 ACT或AC-Hly)是百日咳博德特氏菌的关键致病因子，其是百日咳(1)的病原体。其1706 个残基长度的多肽是N-端腺苷酸环化酶(AC)酶结构域或部分( 400个残基)与构成 C-端部分或结构域O)的 1306个残基的成孔RTX溶血素(在IoXin溶细胞素中重复) 的融合体。后者通过共价翻译后棕榈酰化Lys86tl和Lys983的ε _氨基而包含将proCyaA活化为CyaA的位点，以及包含形成 40个钙结合部位的众多RTX重复，其装载(loading)是 CyaA(3,4)的细胞毒素活性所需的。CyaA蛋白质实际上作为无活性原毒素而被合成，其通过翻译后棕榈酰化两个内部赖氨酸残基(赖氨酸860和98 而被转化为活性毒素。这种翻译后修饰要求与cyaA基因表达附加基因，即位于百日咳博德特氏菌染色体上的cyaA附近的cyaCo毒素主要靶向表达α 32整联蛋白受体的宿主骨髓吞噬细胞，αΜβ2整联蛋白受体也称为⑶lib/⑶18、CR3或Mac-I (5)。所述毒素具体是通过存在于其C-端部分的受体结合部位而与表达⑶lib/⑶18受体的细胞的⑶lib/⑶18受体结合。这些细胞因此是天然毒素的靶细胞，且还是本专利技术多肽的靶细胞。CyaA插入细胞的细胞质膜中并将AC酶结构域易位到所述靶细胞的胞质溶胶中(6，7)。在细胞内，AC被钙调节蛋白激活并催化不受控制的细胞ATP向cAMP的转化，cAMP是激发削弱吞噬细胞杀菌功能的关键第二信使分子(1)。 在高剂量下(> lOOng/ml)，CyaA-催化的ATP消耗成cAMP变成细胞毒性的，并且促进凋亡甚或迅速的坏死性死亡以及⑶Ilb+单核细胞的溶解(8，9)。最近，专利技术人显示，CyaA结合其⑶lib/⑶18受体的N联寡糖(10)。这表明与普遍存在的细胞表面蛋白的葡聚糖或糖脂的低特异性相互作用可解释虽然降低了大约2个数量级，但是能够容易检测到CyaA也穿透缺乏⑶lib/⑶18的细胞。的确，由于AC结构域具有极其高的特异性催化活性，发现CyaA也显著升高哺乳动物和鸟类红细胞、淋巴细胞、淋巴瘤、成神经细胞瘤CHO或气管上皮细胞中的cAMP(l，11)。最近现有技术中已经提出提供也称为类毒素的解毒毒素，其中腺苷酸环化酶的活性减小，特别是基本被抑制。此类CyaA/AC—类毒素可用于实现本专利技术多肽的制备。除提高cAMP之外，所述毒素还在哺乳动物和鸟类红细胞上显示出中等溶血活性。 这是由于形成估计直径为0. 6至0. Snm的小阳离子选择性孔的能力，这些孔使细胞膜透化并最终引发胶体-渗透细胞溶解(1 。最近，专利技术人及其他人已经表明，CyaA的成孔活性与其细胞入侵AC酶活性协同作用并有助于⑶Ilb+细胞上的CyaA总溶细胞效力(13，14)。由于完整的成孔(溶血)能力，在诸如血清的渗透保护剂不存在时，无酶促活性的CyaA/AC—类毒素(1 在红细胞上仍显示完整的溶血活性，并且在⑶lib-表达单核细胞上显示残留的降低约10倍的溶细胞活性(8)，这对其在治疗中的应用设定了限制。早期，发现CyaA的溶血(成孔)和AC膜易位(细胞入侵)活性由于低钙浓度、低温(16)以及由于CyaA酰化的程度和性质(4，12，17)而易分离。此外，两种活性在对疏水结构域内的位置509、516、570和581处的谷氨酸的电荷逆转或中性置换的灵敏度上有很大差异(8，13，18)。CyaA的细胞入侵和成孔活性因此被认为是相互独立的而且在靶细胞膜中平行操作。图5A图解的模型表明，两种不同的CyaA构象体平行插入靶细胞膜中，一个是易位前体，负责将AC结构域经过具有伴随钙离子流入的细胞膜递送到细胞中，另一个是最终形成低聚物孔的孔前体(13，18，19)。专利技术人现在已经测试了这种模型并对其进行修整，显示成孔活性不参与AC结构域经过靶细胞的易位。在本专利技术中，专利技术人最初设计了 CyaA突变多肽，特别是基于百日咳博德特氏菌的腺苷酸环化酶，其处于毒素或类毒素形式，具有在成孔(E570Q)和具酰化(K860R)结构域内的置换组合，并且专利技术人表明，这些特异性置换组合选择性破坏CyaA的细胞透化活性，因此消除了残留的CyaA/AC-类毒素对CDllb+细胞的溶细胞活性。同时，E570Q+K860R构建物保留了将AC结构域易位到细胞胞质溶胶中以提高细胞cAMP的完整能力，并且其类毒素完全能够将所述构建物内插入的含表位分子递送至树突状细胞的胞浆途径，用于体内特异性细胞毒性T细胞应答的MHC类别I-限制呈递和诱导。由专利技术人设计的CyaA/2330VA/E570Q+K860R突变体(如在实施例中所述，OVA抗原肽被插入其中)，是例证CyaA突变体能力的第一构建物，即提供显著降低的透化细胞的能力，同时保留了越过细胞膜易位AC结构域的完整能力。专利技术人现在已经设计出具体构建物，其特别以CyaA/E570Q+K860R/AC_类毒素为例，并且已经显示尽管其细胞透化(溶细胞)活性降低很多，但是其保留了将抗原递送到 ⑶Ilb+APCs中的完整活性。专利技术人还表明，说明性CyaA/E570Q+K860R/AC_类毒素的总溶细胞活性非常低。因此，其在动物或人类宿主中没有残留毒性，并且因此非常适合用于治疗。
技术实现思路
本专利技术因此提供新本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：P塞博，A奥西科瓦，J马辛，C法约尔，J克鲁塞克，M巴斯勒，C莱克勒克，R奥西卡，
申请(专利权)人：巴斯德研究院，捷克微生物研究所，捷克生理学研究所，
类型：发明
国别省市：
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