甘蓝型油菜nap细胞质雄性不育恢复基因Rfn的克隆及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种甘蓝型油菜细胞质雄性不育恢复基因的分离克隆、功能验证和应用。本发明专利技术分离的甘蓝型油菜nap细胞质雄性不育恢复基因Rfn，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，它编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。该基因属于PPR基因家族的成员，为一个组成型表达的基因。将Rfn转化导入不含有nap细胞质恢复基因的油菜，可以获得育性恢复的植株。恢复基因Rfn的克隆及验证可用于甘蓝型油菜优良自交系和常规品种选育，解决部分材料在低温条件下花粉不足、产量下降的现象。

【技术实现步骤摘要】
甘蓝型油菜nap细胞质雄性不育恢复基因Rfn的克隆及其应用
本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一种甘蓝型油菜nap细胞质雄性不育恢复基因及其应用。
技术介绍
植物雄性生殖器官不能产生正常的雄配子即花粉的现象称为雄性不育，具有雄性不育特性的植物或作物品系称为不育系。而一些品系与不育系杂交能够产生具有正常育性的植株，这些植物或作物品系称为恢复系。利用不育系作母本和恢复系作父本杂交进行杂交，可配制高纯度的杂交种。因此，不育系和恢复系在作物杂交育种中具有重要价值。对于雄性不育及其育性恢复的研究在多种农作物如水稻、小麦、玉米、大豆、油菜等已有报道，在生产上已广泛应用于杂交种生产。雄性不育的遗传基础包括核基因控制的细胞核雄性不育(Genicmalesterility,简称GMS)和细胞质控制的细胞质雄性不育(Cytoplasmicmalesterility,简称CMS)。利用CMS及其育性恢复特性进行杂交育种的方法通常称为“三系法”，即不育系、恢复系和保持系。其中不育系具有线粒体基因组中特异基因控制的细胞质雄性不育特性。恢复系具有正常的细胞质或不育的细胞质，花粉正常可育，自交可结实，其特点是核基因组中携带育性恢复基因(fertilityrestorergene，简称Rf)。保持系具有正常的细胞质，花粉正常可育，但其核基因组中不携带有功能的恢复基因。甘蓝型油菜细胞质雄性不育有多种类型，如同源胞质类型napCMS和polCMS；异源胞质类型有oguCMS，tourCMS，hauCMS等。polCMS、oguCMS及tourCMS在国内外油菜杂交育种中有较广泛的应用。由于大部分甘蓝型油菜栽培品种中均含有napCMS的恢复基因而表现为可育。只有少数品种由于缺少恢复基因Rfn而表现为不育或部分不育，同时napCMS不育植株在相对较高的温度情况下就会变为部分可育或完全可育(Fan和Stefan,1986)，限制了该系统在油菜杂交种生产上的应用。然而在甘蓝型油菜自交系或常规品种选育过程中，经常有品种出现分段结实的现象。具体表现为：低温条件下，有效花序段部分花蕾在尚未开放时即黄化脱落，或能正常开花但不能正常发育结实，有的花即使能发育成角果，但每个角果仅有少量种子，而在温度较高的情况下则结实完全正常。这必将导致无效角果增加，产量下降。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一个甘蓝型油菜细胞质雄性不育恢复基因Rfn，利用该基因可恢复甘蓝型油菜napCMS的育性，或作为分子标记，促进甘蓝型油菜优良自交系和常规品种选育。为了实现本专利技术的目的，专利技术人通过大量试验研究并不懈努力，最终从甘蓝型油菜中分离得到一种甘蓝型油菜napCMS的恢复基因Rfn，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:1所示。根据本领域的常规技术手段，本专利技术人可以采用已克隆的多核苷酸序列作为探针，从基因组或cDNA文库中筛选得到本专利技术的基因或同源基因。同样，采用PCR技术也可以从基因组和cNDA中扩增得到本专利技术的基因或任何一段感兴趣的核苷酸序列或与其同源的核苷酸序列。因此，在严格条件下与序列表中SEQIDNO:1所示的核苷酸序列杂交且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列也属于甘蓝型油菜napCMS的恢复基因序列。进一步地，上述任意一种核苷酸序列经核苷酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体也属于甘蓝型油菜napCMS的恢复基因序列。另外，本专利技术还提供了一种表达甘蓝型油菜细胞质雄性不育恢复基因Rfn的蛋白，其氨基酸序列由上述任意一种核苷酸序列编码。进一步优选地，所述表达甘蓝型油菜细胞质雄性不育恢复基因Rfn的蛋白，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.2所示。再者，本专利技术还提供了一种上述甘蓝型油菜细胞质雄性不育恢复基因Rfn的等位基因，其核苷酸序列选自以下的任意一种：(1)序列表中SEQIDNO.3所示的核苷酸序列；(2)在严格条件下与(1)限定的核苷酸序列杂交且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；(3)与(1)或(2)限定的核苷酸序列经核苷酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。最后，本专利技术还提供了上述的甘蓝型油菜细胞质雄性不育恢复基因Rfn在甘蓝型油菜遗传改良中的应用。以及，上述的甘蓝型油菜细胞质雄性不育恢复基因Rfn的等位基因在甘蓝型油菜遗传改良中的应用。与现有技术相比，本专利技术首先提供了一种甘蓝型油菜napCMS的恢复基因Rfn，该基因属于PPR基因家族的成员，为一个组成型表达的基因。将Rfn转化导入不含有nap细胞质恢复基因的油菜，可以获得育性恢复的植株。恢复基因Rfn的克隆及验证可用于甘蓝型油菜优良自交系和常规品种选育，解决部分材料在低温条件下花粉不足、产量下降的现象。另外，以甘蓝型油菜恢复基因Rfn序列本身或附近的序列产生的紧密连锁的分子标记，可用于甘蓝型油菜自交系和常规品种分子标记辅助选择育种。附图说明图1为甘蓝型油菜nap细胞质雄性不育系及其恢复系不同温度条件下的形态。图2为甘蓝型油菜nap细胞质雄性不育系恢复基因Rfn位点的局部遗传连锁图。图3为甘蓝型油菜nap细胞质雄性不育系恢复基因Rfn位点的精细遗传连锁图。图4为覆盖甘蓝型油菜nap细胞质雄性不育恢复基因Rfn区段的物理图谱。图5为甘蓝型油菜功能互补测验表达载体pFGC-Rfn载体示意图。图6为具有181A遗传背景的T0代遗传转化甘蓝型油菜植株开花后育性表型与181A表型的比较。181A遗传转化T0代植株携带显性基因Rfn的候选基因，表现为花丝伸长，育性恢复，花粉粒醋酸洋红染色正常。图7为转基因阳性单株自交后代株系PCR鉴定及育性共分离分析。F为可育株，S为不育株，N为阴性对照，P为阳性质粒对照，M为DL2000分子量标准。具体实施方式以下结合具体实施例对本专利技术做进一步说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术。但是本专利技术能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本专利技术内涵的情况下做类似改进，因此本专利技术的保护范围以权利要求书为准，不受下面公开的具体实施的限制。下述所使用的实验方法若无特殊说明，均为本
现有的常规方法和技术，所使用的试剂配方或材料，均通过商业途径得到。实施例1甘蓝型油菜nap细胞质雄性不育系及其恢复系的发现及遗传分析专利技术人在甘蓝型油菜育种过程中发现，含有nap细胞质的优良自交系181-1在相对低温时花瓣皱缩，雄蕊发育不正常，而在温度相对较高的条件下雄蕊发育基本恢复正常(图1)。通过大量测交发现，优良自交系H5能够在低温条件下专一恢复181-1至正常雄蕊表型，H5与pol不育系1141A、245A、7492A杂交后代均保持不育。H5与181-1杂交F1与181-1回交获得的BC1带在低温条件下可育和不育表现为1:1的分离比，F1自交后代在低温条件下可育和不育表现为3:1的分离比(表1)。后续将181-1命名为181A。表1甘蓝型油菜nap细胞质雄性不育恢复基因的遗传分析*χ2(0.05,1)＝3.84实施例2甘蓝型油菜nap细胞质雄性不育恢复基因的精细定位1.实验材料：本实验用于甘蓝型油菜nap细胞质雄性不育恢复基因的精细定位的亲本材料为181A和H5。由181A与H5杂交获得F1植株，将F1植株自交获得F本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种甘蓝型油菜细胞质雄性不育恢复基因Rfn，其核苷酸序列选自以下的任意一种：(1)序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；(2)在严格条件下与(1)限定的核苷酸序列杂交且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；(3)与(1)或(2)限定的核苷酸序列经核苷酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。

【技术特征摘要】
1.一种甘蓝型油菜细胞质雄性不育恢复基因Rfn，其核苷酸序列选自以下的任意一种：(1)序列表中SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；(2)在严格条件下与(1)限定的核苷酸序列杂交且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；(3)与(1)或(2)限定的核苷酸序列经核苷酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。2.一种表达甘蓝型油菜细胞质雄性不育恢复基因Rfn的蛋白，其氨基酸序列由权利要求1任一所述核苷酸序列编码。3.根据权利要求2所述表达甘蓝型油菜细胞质雄性不育恢复基因Rfn的蛋白，其特征在，该蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQIDN...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨光圣，刘智，董发明，洪登峰，万丽丽，辛强，
申请(专利权)人：华中农业大学，武汉联农种业科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42