表达盒、其转基因鱼及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种表达盒，其包含编码报告蛋白的报告核苷酸序列、从青鳉鱼分离的雌激素反应5′-调控核苷酸序列和可操作地连接到所述报告核苷酸序列3′端的3′-调控区，其中所述调控核苷酸序列可操作地连接到所述报告核苷酸序列的5′端，以在雌激素或雌激素样化合物存在下诱导报告蛋白表达。本发明专利技术还涉及具有上述表达盒的转基因鱼。本发明专利技术还涉及出于各种目的使用所述转基因鱼的方法，所述目的包括例如：(1)鉴定雌激素内分泌干扰物；(2)监测测试样品的雌激素样活性；(3)鉴定抗雌激素内分泌干扰物；和(4)研究内分泌干扰物对肝脏再生的影响。本发明专利技术还公开了宿主细胞和水生动物的转基因细胞等。

【技术实现步骤摘要】

一般而言，本专利技术涉及表达盒、转基因鱼及其特别是在检测雌激素和抗雌激素化合物，监测环境中的雌激素样活性以及研究肝脏的再生中的应用。
技术介绍
现发现曾被视为安全的很多化学物质具有扰乱内分泌系统的活性，并且在生物体内导致不良反应。这些种类的化学品在环境中的广泛存在已近引起了全世界的关注。因为有关这些物质对雄性生物的雌激素效应的报道越来越多，所以大部分研究工作集中于雌激素样内分泌干扰物。重要的是获得用于鉴定能够模拟雌激素或干扰雌激素内分泌系统的化学物质的快速、敏感、经济且可定量的方法，此方法能够有助于评估这些化学物质对生物体的生物效应。在现有技术的方法中，已研究了体外细胞系分析和体内转基因鱼分析。细胞系分析能够快速且敏感，但不能提供关于测试物质对生物体的毒理动力学和毒理代谢动力学作用的信息。目前，转基因鱼分析能够克服细胞系分析的一些缺陷。然而，现有转基因鱼的局限性在于它们都是淡水物种，不能在海洋环境中使用。
技术实现思路
本专利技术一方面涉及表达盒，其包含(i)编码报告蛋白的报告核苷酸序列；(ii)从青鏘鱼(medaka fish)分离的雌激素反应5'-调控核苷酸序列，其中所述调控核苷酸序列可操作地连接到所述报告核苷酸序列的5'端，以在雌激素或雌激素样化合物存在下诱导报告蛋白表达；和(iii)可操作地连接到所述报告核苷酸序列3'端的3'-调控区。本专利技术的另一方面涉及包含本专利技术表达盒的转化载体。本专利技术的另一方面涉及转导有本专利技术表达盒的宿主细胞。本专利技术的另一方面涉及水生动物的转基因细胞，其中所述转基因细胞包含至少一个本专利技术的表达盒。本专利技术的另一方面涉及包含至少一个本专利技术表达盒的转基因鱼。在接触到包含雌激素或雌激素样化合物的液体介质时，所述转基因鱼表现出可观测的标记。所述可观测的标记包括由所述至少一个表达盒表达的报告蛋白。本专利技术的另一方面涉及用于检测液体介质中存在雌激素或雌激素样化合物的转基因鱼的制备方法。此方法包括使用本专利技术的表达盒转化非转基因鱼，从而获得包含至少一个所述表达盒的转基因鱼。本专利技术的另一方面涉及筛选液体介质中雌激素物质的方法。本专利技术的另一方面涉及筛选液体介质中雌激素物质的方法。此方法包括使本专利技术的转基因鱼接触待测(即用于检测雌激素物质的存在)的液体介质。在此接触步骤后，此方法包括检测所述转基因鱼是否表现出通过诱导(包含在所述转基因鱼体中的)报告基因的表达产生的可观测的标记。存在可观测的标记表明所述液体介质包含雌激素物质。本专利技术的另一方面涉及筛选具有抗雌激素活性的化合物的方法。此方法包括以下步骤(a)提供本专利技术的第一转基因鱼和第二转基因鱼，其中所述第一转基因鱼和第二转基因鱼为相同的种，并且处于基本相同的发育阶段；(b)使所述第一转基因鱼接触第一液体介质，其中所述第一液体介质包含雌激素或雌激素样化合物；(c)使所述第二转基因鱼接触第二液体介质，其中所述第二液体介质包含第一液体介质和测试化合物；和(d)将所述第一转基因鱼表现出的任何可观测的标记的定量强度与所述第二转基因鱼表现出的任何可观测的标记的定量强度进行比较，其中与所述第一转基因鱼中可观测的标记的定量强度相比，所述第二转基因鱼中可观测的标记的定量强度下降表明所述测试化合物具有抗雌激素活性。本专利技术的另一方面涉及用于研究雌激素化合物对肝脏再生的影响的方法。总体而言，此方法包括对本专利技术的成体转基因鱼进行部分肝切除，其中所述部分肝切除是有效去除所述转基因鱼的部分肝脏；使所述转基因鱼接触包含测试雌激素化合物的测试液体介质；和分析所述转基因鱼的肝脏以检测肝组织的任何再生。与研究单一的雌激素化合物相反，本专利技术的另一方面涉及用于研究不同雌激素化合物对肝脏再生的影响的方法。总体而言，此方法包括以下步骤(a)提供本专利技术的第一转基因鱼和第二转基因鱼，其中所述第一转基因鱼和第二转基因鱼为相同种的成体鱼；(b) 使所述第一转基因鱼接触包含第一测试雌激素化合物溶液的第一液体介质；(c)使所述第二转基因鱼接触包含第二测试雌激素化合物溶液的第二液体介质；(d)量化所述第一转基因鱼和所述第二转基因鱼表现出的任何可观测的标记的强度；(e)对所述第一转基因鱼和第二转基因鱼进行部分肝切除，其中所述部分肝切除是有效去除所述第一转基因鱼和第二转基因鱼的部分肝脏；(f)重复此方法的步骤(b)到步骤(d)；和(g)分析所述第一转基因鱼和第二转基因鱼的肝脏以比较所述第一液体介质和所述第二液体介质中包含的雌激素化合物对肝组织任何再生的影响。附图说明本专利或申请文件包含至少一幅彩色的附图。基于请求并收取必要的费用，专利局可提供带有彩色附图的本专利或专利申请副本。图1显示通过绿色荧光(GFP)阳性幼体的频率所代表的不同长度的omChgH5’-上游区的相对启动子活性，其中所述GFP阳性幼体源自于注射有核酸序列的胚胎，所述核酸序列包含对17 β -雌二醇反应的omChgH启动子-EGFP (增强型绿色荧光蛋白)。图2显示不同基因的mRNA聚腺苷酸化信号对核酸omChgH启动子-EGFP的相对启动子活性的影响，核酸omChgH启动子-EGFP的相对启动子活性由GFP阳性幼体的频率所代表，其中所述GFP阳性幼体源自于注射有核酸的胚胎，所述核酸包含对17 β -雌二醇反应的，侧翼为olChgH、SV40或omChgH3’ -侧翼区的omChgH启动子-EGFP (增强型绿色荧光蛋白)。图3A-3G显示转基因EGFP在通过引入包含omChgH启动子-EGFP转基因的核酸序列而产生的转基因鱼中的天然和诱导表达。GFP的表达仅局限于成体雌鱼的肝脏(图3C)， 而不在胚胎(图3A)、幼体(图3B)或雄鱼(图3D)中表达。图3E-3G显示通过17 β -雌二醇也可在胚胎、幼体和雄鱼的肝脏中诱导转基因EGFP的表达。图4显示使用本专利技术的转基因鱼幼体分析测试溶液的雌激素样活性的一个实施方式的操作流程图。图5显示孵化后不同天数的转基因鱼幼体的雌激素敏感性。图6是显示在5 9范围的pH不影响转基因鱼幼体对17 β -雌二醇反应的图。图7是显示0 35ppt的盐度不影响转基因鱼幼体对17 β -雌二醇反应的图。图8显示对雌激素反应转基因幼体中GFP信号强度随时间推移而增加。图9显示转基因鱼幼体对17 β -雌二醇的剂量-反应。图10显示转基因鱼幼体对合成激素17 β -乙炔雌二醇的剂量-反应。图11显示分别由植物雌激素染料木黄酮、染料木苷、大豆苷原、大豆苷以及从豆浆提取的它们的组合物诱导的肝GFP信号。图12显示由UV过滤剂ΒΡ-3和4-MBC单独及组合诱导的肝GFP信号。使本专利技术一个实施方式的转基因鱼幼体接触4-MBC (5 μ M)、HMS (5 μ Μ)和以上述一半浓度O. 5 μ Μ) 混合的这两种化合物的组合。由其混合物诱导的GFP信号显著高于由这两种化合物诱导的 GFP信号。图13显示由单独的17 β -雌二醇，或者17 β -雌二醇与UV过滤剂B-MDM、OMC或 OD-PABA的组合诱导的肝GFP信号。图14显示HMS能够以剂量依赖的方式提高17 β -雌二醇诱导的肝GFP信号。图15显示多环麝香AHTN能够降低17 β -雌二醇诱导的肝GFP信号。具体实施例方式一方面，本专利技术涉及包含表达盒的转基因鱼，所述表本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种表达盒，其包含：编码报告蛋白的报告核苷酸序列；从青鳉鱼分离的雌激素反应５′－调控核苷酸序列，其中所述调控核苷酸序列可操作地连接到所述报告核苷酸序列的５′端，以在雌激素或雌激素样化合物存在下诱导报告蛋白表达；和可操作地连接到所述报告核苷酸序列３′端的３′－调控区。

【技术特征摘要】
2010.03.24 US 12/730,9561.一种表达盒，其包含编码报告蛋白的报告核苷酸序列；从青鏘鱼分离的雌激素反应5'-调控核苷酸序列，其中所述调控核苷酸序列可操作地连接到所述报告核苷酸序列的5'端，以在雌激素或雌激素样化合物存在下诱导报告蛋白表达；和可操作地连接到所述报告核苷酸序列3'端的3'-调控区。2.如权利要求1所述的表达盒，其中所述5'-调控核苷酸序列分离自黑点青鏘鱼。3.如权利要求2所述的表达盒，其中所述5'-调控核苷酸序列源自黑点青鏘卵壳蛋白H基因的启动子区，所述卵壳蛋白H基因具有SEQ ID NO :1的核苷酸序列。4.如权利要求3所述的表达盒，其中所述源自黑点青鏘卵壳蛋白H基因的启动子区的 5'-调控核苷酸序列包含选自SEQ ID NO 2,SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4组成的组的核苷酸序列。5.如权利要求1所述的表达盒，其中所述报告蛋白是自体荧光蛋白。6.如权利要求5所述的表达盒，其中所述自体荧光蛋白选自增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)、绿色荧光蛋白(GFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、黄色荧光蛋白(YFP)和红色荧光蛋白 (RFP)组成的组。7.如权利要求1所述的表达盒，其中所述3'-调控区包含mRNA聚腺苷酸化信号。8.如权利要求7所述的表达盒，其中所述mRNA聚腺苷酸化信号是青鏘鱼卵壳蛋白H基因的3'-侧翼区，所述青鏘鱼选自黑点青鏘和日本青鏘组成的组。9.如权利要求8所述的表达盒，其中所述卵壳蛋白H基因的3'-侧翼区包含卵壳蛋白H基因的3’ -UTR(非翻译区)和聚腺苷酸化尾序列。10.如权利要求1所述的表达盒，其中所述3'-调控区包含SEQID NO :5的核苷酸序列。11.一种转化载体，其包含权利要求1的表达盒。12.—种宿主细胞，其是由权利要求1的表达盒转导的宿主细胞。13.—种水生动物的转基因细胞，所述转基因细胞包含至少一个权利要求1的表达盒。14.如权利要求13所述的转基因细胞，其中所述水生动物选自青鏘种和鲤种组成的组。15.如权利要求14所述的转基因细胞，其中所述青鏘种选自黑点青鏘和日本青鏘组成的组。16.一种转基因鱼，其包含 至少一个权利要求1的表达盒，其中所述转基因鱼在接触包含雌激素或雌激素样化合物的液体介质时表现出可观测的标记，并且其中所述可观测的标记包含由至少一个表达盒表达的报告蛋白。17.如权利要求16所述的转基因鱼，其中所述可观测的标记是在体内可见的。18.如权利要求16所述的转基因鱼，其中所述鱼是半咸水鱼。19.如权利要求18所述的转基因鱼，其中所述半咸水鱼是黑点青鏘鱼。20.如权利要求16所述的转基因鱼，其中所述鱼处于选自由胚胎阶段、幼体阶段和成体阶段组成的组的发育阶段。21.如权利要求16所述的转基因鱼，其中所述鱼是雄性成体鱼。22.一种用于检测液体介质中雌激素或雌激素样化合物存在的转基因鱼的制备方法， 所述方法包括使用权利要求1的表达盒转化非转基因鱼，从而获得包含至少一个所述表达盒的转基因鱼。23.如权利要求22所述的方法，其中所述鱼是黑点青鏘鱼。24.一种筛选液体介质中雌激素物质的方法，所述方法包括使权利要求16的转基因鱼接触用于检测雌激素物质的存在的液体介质；和测定所述转基因鱼是否表现出通过诱导报告基因表达产生的可观测的标记， 其中所述可观测的标记的存在表明所述液体介质包含雌激素物质。25.如权利要求M所述的方法，其中所述液体介质包括已添加有目标测试物质的水样。26.如权利要求M所述的方法，其中所述液体介质包括未添加目标测试物质的水样。27.如权利要求M所述的方法，其中所述测定步骤包括体内自体荧光显微镜检查，其中所述报告基因编码自体荧光报告蛋白。28.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑淑娴，陈雪平，
申请(专利权)人：香港城市大学，
类型：发明
国别省市：HK