本发明专利技术公开了一种控制鱼类生殖的方法，其步骤：A，构建重组基因CMV-eGFP-SV40-CMV-Gal4-SV40，建立转GAL4基因斑马鱼家系；B，构建重组基因CMV-RFP-SV40-UAS-antisensednd，建立转uas-antisensednd基因斑马鱼家系；C，以两个家系的转基因鱼纯合子为亲本杂交，杂交后代鱼生殖败育。本发明专利技术通过两系可育而杂交子代诱导不育的策略，建立了一种具有普遍意义的控制鱼类育性的新方法。该方法解决了生殖操作研究中鱼的不育性与性状的可遗传性间的矛盾，能有效运用于鱼类新品种培育和种群控制。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及水产动物遗传育种
，更具体涉及。采用鱼类亲本两系可育而杂交子代诱导不育的策略，分别建立转gal4基因鱼家系和UAS驱动的转反义dnd基因鱼家系，将两个家系的转基因鱼杂交，可以在杂交子代中控制鱼类的生殖发育，从而建立控制鱼类生殖的操作技术，培育出性腺败育的鱼类新品系。
技术介绍
生长速度、肉质等性状是鱼类品种改良的主要目标，而鱼类的生殖发育特性与这些重要性状的关系非常密切。鱼类能量生物学研究表明，如果控制了鱼类的生殖发育，其摄取的食物将更有效地转化成体细胞的发育，从而促进生长。很多鲑鳟鱼类性腺成熟排出性产物后，肉质变得很差；而性腺发育不发育的鱼体肌肉组织中人体必需氨基酸、呈味氨基酸的含量都比较高。因此，实施鱼类生殖发育调控，对于培育具有优良性状的养殖鱼类新品系具有重要指导意义。世界上第一批转基因鱼问世以来(ZhuZ, Li G, He L, et al.Novel gene transferinto the fertilized eggs of goldfish(Carassius auratus L.1758).Z angewIchthyol，1985，1:31-34。)，以提供优质食品蛋白来源为目的，迄今已成功研制了 30多种转基因鱼。经遗传改良后的转基因鱼具有生长速度快，饵料转化效率高，抗冻耐寒，抗疾病能力强等优良性状。但是，迄今尚无一例转基因鱼进行产业化养殖，制约转基因鱼产业化的瓶颈因素在于对其可能的生态风险的担忧。从科学的角度而言，转基因鱼潜在的生态风险实质与其生殖特性密切相关。控制转基因鱼的生殖，可以从根本上解决转基因鱼的潜在生态风险(Hu Wei, Wang Yaping & Zhu Zuoyan.Progress in the evaluation of transgenicfish for possi—ble ecologic al risk and its containment strategies.Science inChina Ser C-Life Sc1.2007,50:573-579.)。反义转GnRH基因策略是目前控制转基因鱼生殖的首选技术(MacleanN, Laight R J.Transgenic fish:an evaluation of benefits and risks.Fish andFisheries，2000，1:146-172)。该技术首先通过反义转基因阻遏与鱼类性腺发育或性成熟相关基因GnRH的表达，进而抑制其性腺发育，控制转基因鱼的生殖；在此基础上，恢复不育的转基因鱼的生理育性，以最终获得无生态风险之虞的育性可控的转基因鱼。但是，采用该技术即使获得了性腺完全不发育的转基因鱼，如何将转基因鱼“不育”的性状遗传给子代并建立家系，从逻辑学角度看是一个难以理解的悖论，在遗传上则是一个难以实现的难题。尽管理论上可以通过人工补给外源激素恢复不育转基因鱼的生理育性，但相关研究发现，鱼类中GnRH在鱼脑中的表达最早可起始于受精发育的第一天，本实验室发现在此阶段补充外源GnRH对胚胎发育以及幼鱼生长有抑制作用，这些限制造成育性恢复成功率很低。而且，即使恢复了极少数不育转基因鱼的生理育性，其产生的精子或卵子量非常少，难以满足大规模生产需要。Gal4/UAS系统有可能成为一种较理想的诱导型的基因表达系统而应用于鱼类生殖发育调控。半乳糖调节上游启动子元件Gal4 (Galactose regulated upstream promoterelement, Gal)是酵母中类似原核生物乳糖操纵子的一个转录激活子，Gal4蛋白既有DNA结合功能域，又有转录激活功能域。上游激活序列UAS (Upstream active sequence, UAS)是酵母中另一种类似高等真核生物增强子的序列。Gal4只有在识别UAS时才能激活与UAS相连接的下游基因的转录，对基因的诱导表达具有强烈的特异性及可控性(MarnieE.Halpern, Je rry Rhee, Mary G.Goll, Courtney Μ.Akitake, Michael Parsons,andSteven D.Leach.Gal 4/UAS Transgenic Tools and Their Application to Zebrafish.Zebrafish, 2008，5(2):97-110.)。原始生殖细胞是生殖细胞的前体细胞，dead end (dnd)基因在原始生殖细胞的存活和迁移具有重要作用(Gilbert Weidinger et al.dead end, a Novel Vertebrate GermPlasm Com ponent,Is Required for Zebrafish Primordial Germ Cell Migration andSurvival, Current bi ology, 2003，(13): 1429-1434.),抑制 dead end (dnd)基因的表达,可以抑制原始生殖细胞的正常迁移，从而抑制生殖细胞的形成和成熟。斑马鱼(Danio rerio)是目前广泛应用于发育生物学、水生生物技术等研究的模式鱼(Westerfield M.1993.The Zebrafish Book:A Guide for the Laboratory Use ofZebrafish (Brachydanio rerio).University of Oregon Press, Eugene, OR.),以斑马鱼为模型探索控制鱼类生殖的新方法，对于建立鱼类的生殖开关技术，培育性腺败育的经济性养殖鱼类优良品种以及控制自然环境中的外来鱼类种群等方面具有重要的指导意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了一种控制鱼类生殖发育的方法。该方法由两个相对独立但又相互联系的转基因鱼家系组成:一个家系转入由强启动子CMV驱动的表达GAL4的载体，另一家系则转入与UAS序列融合的反义dnd基因载体。两个家系的转基因鱼单独存在时均可正常产生成熟的生殖细胞，可以将性状稳定遗传给后代。但是，一旦两个转基因家系杂交，在杂交后代中，GAL4将诱导UAS驱动其下游的反义dnd表达，从而抑制内源dnd基因的表达，鉴于dnd基因在原始生殖细胞的存活和迁移具有重要作用，因此，杂交后代个体中的原始生殖细胞无法完成正常迁移，最终导致生殖细胞无法形成，由此获得生殖败育的鱼。该方法可以成为一种全新的鱼类生殖操作育种新技术，应用于培育具有优良性状的养殖鱼类新品系、并可运用于控制外来鱼种的种群。为了达到上述的目的，本专利技术采用以下技术措施:重组基因的构建，其步骤是:(I)重组基因 CMV-eGFP-SV40-CMV-Gal4-SV40 的构建:以 4xKGFP 载体(Martin Distela et al.0ptimized Gal4genetics for permanent gene expressionmapping in zebrafish.PNAS, 2009, 106:65-70.)为初始载体，经过改造得到pSK-CMV-eGFP-SV40-CMV-MCS-SV40载体(其本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种控制鱼类生殖的方法，其步骤是：（1）外源基因导入：采用显微注射法将重组基因CMV?eGFP?SV40?CMV?Gal4?SV40和CMV?RFP?SV40?UAS?antisense?dnd分别导入斑马鱼受精卵中，得到P0代转GAL4基因斑马鱼和转UAS?antisense?dnd基因斑马鱼；所述的重组基因CMV?eGFP?SV40?CMV?Gal4?SV40，其序列为SEQ?ID?NO.1所示；所述的重组基因CMV?RFP?SV40?UAS?antisense?dnd，其序列为SEQ?ID?NO.2所示；（2）获得转基因鱼纯合子：表达绿色荧光蛋白的为P0代转GAL4基因斑马鱼；表达红色荧光蛋白的为P0代转UAS?antisense?dnd基因斑马鱼；将两种P0代转基因斑马鱼分别与对照斑马鱼杂交，分别获得F1代转GAL4基因斑马鱼和转UAS?antisense?dnd基因斑马鱼；将F1代转基因GAL4斑马鱼自交，在F2代中获得转GAL4基因斑马鱼纯合子；将F1代转UAS?antisense?dnd基因斑马鱼自交，在F2代中获得转UAS?antisense?dnd基因斑马鱼纯合子；（3）转基因鱼杂交：以转GAL4基因斑马鱼纯合子和转UAS?antisense?dnd基因斑马鱼纯合子为亲本，进行两个家系的转基因鱼杂交，两个家系杂交产生的后代鱼生殖败育。...
【技术特征摘要】
1.一种控制鱼类生殖的方法，其步骤是: (1)外源基因导入:采用显微注射法将重组基因CMV-eGFP-SV40-CMV-Gal4-SV40和CMV-RFP-SV40-UAS-antisense /分别导入斑马鱼受精卵中，得到PO代转GAL4基因斑马鱼和转例基因斑马鱼； 所述的重组基因CMV-eGFP-SV40-CMV-Gal4-SV40，其序列为SEQ ID N0.1所示； 所述的重组基因 CMV-RFP-SV40-UAS-antisense /，其序列为 SEQ ID N0.2 所示； (2)获得转基因鱼纯合子:表达绿色...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡炜，张运生，戴军，朱作言，
申请(专利权)人：中国科学院水生生物研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。