一种高效标记斑马鱼PGC的载体及转基因鱼的制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种高效标记斑马鱼PGC的载体及转基因鱼的制备方法和用途。利用Gal4/UAS转录激活系统，以mRFP作为报告基因，实现斑马鱼原始生殖细胞中诱导基因表达调控技术。首先分别构建激活转基因品系Tg(kop:KalTA4)和效应转基因品系Tg(UAS:mRFP)。然后将Tg(kop:KalTA4)雌鱼与Tg(UAS:mRFP)雄鱼杂交就能获得高效标记斑马鱼原始生殖细胞的转基因鱼。这种高效标记斑马鱼原始生殖细胞的转基因鱼在鱼类生物工程具有广泛应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于鱼类生物工程
，本专利技术涉及一种高效标记斑马鱼PGC的载体，还涉及一种高效标记斑马鱼原始生殖细胞的转基因鱼的制备方法，还涉及该转基因斑马鱼在鱼类生物工程技术的用途。
技术介绍
作为遗传物质的传递者，鱼类原始生殖细胞(Primordial germ cell，PGC)因其具有全能性已成为了鱼类生物工程技术的崭新的工具(Yoshizaki，G.,Takeuchi’Y-and Okutsu, T.(2007).^Germ cell in fish:basic biology and biotechnologicalapplications.^Tanpakushitsu Kakusan Koso52, 2067-2072.)。然而，缺乏良好的标记系统仍然是原始生殖细胞操作的一大障碍。因此，有必要将目前的分子遗传学技术运用到原始生殖细胞中，以便更好的分析生殖细胞发育过程中的分子机制和对其进行遗传操作。目前已经有一些研究报道建立了观察原始生殖细胞的方法，例如通过早期注射nosl3’ UTR调控荧光蛋白表达的mRNA可以快速简便地标记斑马鱼原始生殖细胞(Koprunner, M., Thisse, C., Thisse, B.and Raz, Ε.(2001).〃A zebrafish nanos-relatedgene is essential fo r the development of primordial germ cells."GenesDevl5, 2877-2885.)，但是利用这种方法荧光蛋白在发育早期并没有非常特异地在原始生殖细胞中表达，而且也不适用于在发育晚期观察原始生殖细胞。同时，研究者们也利用原始生殖细胞的marker基因vasa的启动子和3’ UTR驱使的GFP表达构建了转基因品 vas::EGFP(^Expression of a vas::EGFP transgen e in primordial germ cellsof the zebraf ish.^Mech Devl 16, 141-150 ; Fan, L., Moon, J., Wong, T.T., Crodi an, J.and Collodi, P.(2008)^ Zebrafish primordial germ cell cultures der ived fromvasa::RFP transgenic embryos."Stem Cells Devl7, 585-597.)。在 vas::EGFP 品系胚胎中，母源的vas::EGFP mRNA和VAS::EGFP蛋白在体节后主要在原始生殖细胞中聚集，且到受精后13天仍能能在原始生殖细胞中持续观察到GFP。利用该品系胚胎，Fan等(Fan, L., Moon, J., Wong, T.T., Crodian, J.and Collodi, P.(2008) ^Zebrafish primordialgerm cell cultures derived from vasa::RFP transgenic embryos.〃Stem CellsDevl7, 585-597)用流式细胞仪分离出荧光标记的斑马鱼体节期原始生殖细胞进行了体外培养。然而，在体节以前，母源表达荧光蛋白VAS::EGFP蛋白分布于整个卵裂球，并不特异于原始生殖细胞中(Kr ovel, A.V.and Olsen, L.C.(2002) "Expression of a vas::EGFPtransgene in primordial ger m cells of the zebrafish.〃Mech Devll6.141-150)。为了避免母源效应，vas::EGFP雄鱼与野生型雌鱼的杂交后代是从14-126天才开始表达EGFP,无法特异观察到早期原始生殖细胞(Wang, X.G., Bartfai, R., Sleptsova-Freidrich, 1.and Orban, L.(2007)〃The timing and extent of' juvenile ovary' phase arehighly variable during zebrafish testis differentiation.".Tournal of FishBiolog1TO, 33-44.)，所以利用vas::EGFP转基因品系并不利于胚胎发育早期操作原始生殖细胞。为了能在发育早期观察原始生殖细胞的迁移和分化，Blaser等人利用kop启动子和nosl3’ UTR构建了 Tg(kop:EGFP)品系能够在发育早期特异地在原始生殖细胞中表达EGFP (Blaser, H., Eisenbeiss, S., Neumann, M., Reichman-Fried, Μ., Thisse, B., Thi sse, C.and Raz, E.(2005)"Transition from non-motiIe behaviour to directed migrationduri ng early PGC development in zebraf ish.Cell Sci 118, 4027-4038)。由于kop启动子的母源表达效应和nosl3’ UTR的定位作用，Tg(kop:EGFP)自交胚胎中EGFPmRNA从受精卵开始就定位于生殖质和原始生殖细胞中，从而可以利用Tg(kop:EGFP)从发育早期追踪观察原始生殖细胞的迁移和分化过程。然而由于母源性启动子kop表达的EGFP-UTRnoslmRN A的含量不高，导致EGFP的荧光强度非常弱，对观察原始生殖细胞的发育带来不便。Gal4/UAS系统在很多生物的特异组织中都具有转录放大作用(Halpern，Μ.Ε., Rhee, J., Gol I, Μ.G., Akitake, C.Μ., Parsons, Μ.and Leach, S.D.(2008) "Gal4/UAStransgenic tool s and their application to zebrafish.〃Zebrafish5, 97-110.)。利用Gal4/UAS系统控制基因表达的策略是首先利用组织特异性的启动子或增强子，将Gal4基因与启动子或增强子相连接，建立Gal4转基因系，通过这种启动子以细胞和组织特异性的方式来控制Gal4的表达。同时建立Gal4识别序列UAS (Upstream ActivationSequence)与靶基因相融合的转基因系。U AS-靶基因系中靶基因处于转录沉默状态，只有将Gal4转基因系与UAS-靶基因系进行杂交，才可能产生在特异组织中表达靶基因的后代(Traven, A., Jelicic, B.and Sopta, Μ.(2006)^Yeast Gal4:a transcriptionalparadigm revisited."ΕΜΒ0 Rep7,496-499;Scheer, N.and Campos-Ortega, J.A.(1999)〃Use of the Gal4-UAS technique for tar本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效标记斑马鱼原始生殖细胞的载体，其特征在于，转基因载体pTol2(kop:KalTA4?UTRnos1,?CMV:EGFP?SV40)，其序列为SEQ?ID?NO.1所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙永华，熊凤，魏志强，朱作言，
申请(专利权)人：中国科学院水生生物研究所，
类型：发明
国别省市：