本发明专利技术涉及一种洋葱育性恢复的cDNA分子标记及其应用，属于生物技术技术领域。本发明专利技术提供一种洋葱育性恢复的cDNA分子标记，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；鉴别上述cDNA分子标记的特异引物，上游引物F240核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，下游引物R240核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示；以及上述cDNA分子标记及特异引物在鉴别洋葱质核互作雄性不育育性恢复系及保持系材料中的应用。本发明专利技术所述的cDNA分子标记稳定；辅助选择操作简便，节约成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种洋葱育性恢复的cDNA分子标记及其应用，属于生物技术
技术介绍
洋葱(Allium cepa L.)，又称圆葱、葱头，百合科、葱属，二年生植物，已有5000多年的栽培历史，是一种世界性蔬菜，至少有175个国家栽培洋葱。据FAO (2009)统计，世界洋葱种植面积370万公顷，产量7230万吨，在所有的蔬菜作物中，其种植面积居第二位，产量居第三位；其中，我国具有世界最大的洋葱生产面积和产量，生产面积超过100万公顷，总产量2107万吨，约占全世界产量的30%。洋葱素有保健食品的美称，不仅可鲜食，还大量用于加工制品，富含多种硫化物和糖类是其独特风味的主要成分，具有降低和预防血栓形成， 降血脂、降血压、抗动脉硬化、预防心肌梗塞的作用，深受消费者的喜爱。自 1925 年 Jones 首先在“意大利红”(Italian Red)品种中发现雄性不育株后，国外便开始了洋葱杂种优势利用的研究，开创了蔬菜杂交育种的先例。我国洋葱栽培历史较短，品种资源较匮乏，目前种植的品种可分为红皮、黄皮及白皮洋葱，栽培品种以常规品种为主，随着农业产业结构的调整，对洋葱优良品种的需求日益增加。我国上世纪八十年代从日本、美国等国家引种杂交品种，其品质、产量及一致性都明显优于常规种。由于洋葱品种选育的周期长，为普通蔬菜作物白菜、萝卜的2-4倍，生产上主要以进口品种为主，缺少具有自主知识产权的杂交一代品种，因此，需要花费大量的外汇从国外进口杂交种，导致洋葱生产成本居高不下，增加了农民生产负担和种植风险。要改变我国在洋葱育种领域上的落后局面，关键在于尽快广泛收集品种资源，走现代分子生物学技术与常规育种相结合的道路，加快分子标记辅助选择以及雄性不育系利用的研究。因此，不育系、保持系和父本自交系的筛选鉴定工作已成为目前亟待解决的问题，并且已成为制约洋葱产业发展的关键性环节。目前，在洋葱质核互作雄性不育的鉴定中，细胞质鉴定的分子标记研究已经取得了显著的进展。但是在细胞核鉴定上，由于洋葱基因组DNA巨大(17. 9pg) ，每条染色体上的核苷酸有15，^OMbp，是玉米基因组的6倍、番茄的16107 ,国内夕卜均未取得突破性进展。G0k9e和Havey在两个开放授粉的洋葱群体内，以 A0B272标记为辅助工具，尝试选择保持系，但发现该标记与保持系几乎没有关联。原因可能是在长久的开放授粉环境下，A0B272标记与Ms位点之间已经进行了充分的染色体交换，因此只用该分子标记无法准确地在开放授粉群体中选出保持系。尽管如此，该标记对洋葱恢复基因的研究上仍具有非常重要的意义。基因标记的目的是实现分子标记辅助选择育种(Marker Assisted Selection, MAS)。洋葱质核互作雄性不育细胞质和细胞核分子标记的开发与利用可大大减少工作量， 提高育种效率。虽然目前可以利用与细胞质位点雄性不育连锁的标记鉴别出单株的细胞质类型，淘汰可育材料中S型细胞质，只从N型细胞质类型的单株中选保持系，从而减少测交组合数和自交株数，减少工作量，避免盲目性，提高了选择效果。然而在细胞核的鉴定上，仍需田间杂交、测交进行两代试验、4_6年的时间。因此，洋葱细胞核标记的开发可以减少鉴定杂交后代的工作量、时间消耗以及试验成本。获得洋葱细胞核育性标记，剔除育性恢复材料，筛选保持系，对于洋葱不育系和保持系配套，选育洋葱杂交种具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种洋葱育性恢复的cDNA分子标记及由该分子标记设计的特异引物，该cDNA分子标记及特异引物能对洋葱花蕾期的花蕾 cDNA进行快速准确鉴定，剔除育性恢复材料，筛选保持系，从而加快洋葱质核互作雄性不育新品系的选育，建立新型的洋葱杂交种亲本选配体系。一种洋葱育性恢复的cDNA分子标记，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。鉴别上述cDNA分子标记的特异引物，上游引物F240核苷酸序列如SEQ ID N0. 2 所示，下游引物R240核苷酸序列如SEQ ID N0. 3所示。上述cDNA分子标记及特异引物在鉴别洋葱质核互作雄性不育育性恢复系及保持系材料中的应用。上述应用，步骤如下 提取洋葱样本花蕾期的花蕾总RNA，然后将总RNA反转录为cDNA，再经过上述特异引物PCR扩增后，检测是否含有上述cDNA分子标记，含有上述cDNA分子标记的样本即为洋葱质核互作雄性不育育性恢复材料样本，剔除育性恢复材料，结合表型性状或者细胞质标记即可筛选出育性保持材料样本。提取洋葱样本花蕾期的花蕾总RNA，采用Trizol法进行操作(试剂盒购自 Invitrogen, California, USA ；操作步骤按产品说明书)。所述总RNA反转录为cDNA可按现有技术进行操作，也可按参照fesykript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 产品说明书的步骤操作(购自 TransGen Biotech, Beiiing, China)所述特异引物PCR扩增，反应体系如下25 μ L 体系，其中含 Mg2+的 10XPCR Buffer 2. 5μ L,2. 5mM dNTPs 2.0 μ L(每种脱氧核苷酸浓度均为2. 5mM),0. 5ymol/L上游引物F2401. 0 μ L、0. 5 μ mol/L下游引物 R2401. 0 μ L，模板 DNA 1. 0 μ L(IOOpg)，5U/ μ L Taq DNA polymerase 0. 3 μ L, ddH20 17. 2μ L ；反应程序如下94°C 预变性 4min ；94°C 变性 30sec，53°C退火 30sec，72°C 延伸 30secJ9 个循环； 72°C 延伸 5min，4°C 保存；检测是否含有上述cDNA分子标记，步骤如下将经过PCR扩增后的产物于1. 5%琼脂糖凝胶进行电泳，电压140v，电泳时间30 分钟，溴化乙啶染色后，与同样经上述条件于1. 5%琼脂糖凝胶进行电泳后溴化乙啶染色的 DNA分子标记进行比较，如果在距泳道起始点相同距离的位置有条带，则含有cDNA分子标记。上述操作步骤及操作条件如无特殊说明，均按本领域常规操作步骤及操作条件实施。有益效果本专利技术选用洋葱细胞质雄性不育材料(118)及其相应的育性恢复材料(12-10)杂交，然后用后代可育株单株S (Msms)与母本不育系118回交，根据回交一代的育性分离分为可育群体S (Msms)和不育群体S (msms)。从可育和不育群体中分别各选择8株，构建可育池和不育池。然后用蕾期花蕾总RNA的cDNA模板进行SRAP分析，获得了在恢复材料中特异表达的片段，并根据该特异表达的片段设计了鉴定细胞核的稳定的cDNA分子标记特异引物， 为洋葱分子标记辅助选择育种体系奠定了基础，与目前技术相比，其优点是(l)cDNA分子标记稳定本专利技术选用洋葱质核互作雄性不育材料(118)及其相应的育性保持材料018)、恢复材料(12-10)回交一代分离群体中可育和不育株组的蕾期花蕾cDNA为模板进行扩增，获得了恢复材料特异表达片段的cDNA分子标记，并对不同来源的其他六份材料进行了验证，其表型与分子标记鉴定结果完全一致。(2)分子标本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种洋葱育性恢复的ｃＤＮＡ分子标记，核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤＮＯ．１所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴雄，霍雨猛，刘冰江，缪军，杨妍妍，张一卉，
申请(专利权)人：山东省农业科学院蔬菜研究所，
类型：发明
国别省市：88
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