本发明专利技术的18F标记Cys-Annexin V的方法，采用18F-FBEM标记Cys-Annexin V，标记率高、可实现18F定位标记Cys-Annexin V，且标记后的18F-FBEM-Cys-Annexin V与PS保持良好的亲和性，作为PET显像剂可实现良好的显像效果，具有较为理想的显像特异性。
【技术实现步骤摘要】
一种18F标记Cys-AnnexinV的方法及其应用
本专利技术属于PET显像领域，具体涉及一种18F标记AnnexinV的方法及其应用。
技术介绍
细胞凋亡(Apoptosis)又称程序性细胞死亡(ProgrammedCellDeath，PCD)，是不同于坏死和意外死亡的、由基因调控的细胞主动性死亡过程。作为细胞生命周期中的重要组成部分，细胞凋亡的过程中伴随着一系列的生物分子及细胞形态学的改变。其中，细胞膜脂质双层中的磷脂酰丝氨酸(PS)由细胞膜内层翻转至外层，进而暴露于细胞表面，是细胞凋亡早期事件，发生在凋亡细胞形态学的改变之前，也是凋亡级联反应的初始事件。PS的外翻作为凋亡细胞被吞噬细胞识别的标志，将会进一步引起胞浆的皱缩、染色质的浓集及核内DNA降解等现象。因此，外翻的PS作为凋亡检测的靶点，具有较高的时效性，可早期检测细胞凋亡。目前，在利用检测外翻的PS来获知细胞凋亡情况的技术中，正电子断层显像(positronemissiontomography，PET)是常用的技术手段之一，其主要是利用11C、13N、15O或18F等放射性核素标记的、可与PS特异性结合的物质作为显像剂，通过显像剂在代谢中聚集与分布的呈像，来获知细胞凋亡的情况，从而达到诊断的目的。在可与PS特异性结合的物质中，以AnnexinV作为PET显像剂的相关技术具有良好的应用前景。AnnexinV(膜联蛋白V，又称AnnexinA5和AnxA5)是一种人体内源性蛋白，属于Ca2+依赖性磷脂结合蛋白家族，含有319各氨基酸，包括70-80个氨基酸重复单元，分子量约为35kD。研究表明，AnnexinV与PS特异性结合的亲和力高达10-9mol/L，其在被放射性核素标记、进而作为PET显像剂进行体内细胞凋亡的显像时，可实时监测体内凋亡的发生并且可实现细胞凋亡的活体无创显像，因此，已成为监测活体细胞凋亡领域的研究热点。在对AnnexinV进行正电子核素标记的技术中，以18F标记AnnexinV的18F-SFB-AnnexinV最为常见。但是，由于18F-SFB-AnnexinV是通过功能基团(18F-SFB)连接AnnexinV中赖氨酸残基上的氨基，进而标记上放射性核素的，而一分子的AnnexinV蛋白中含有21个赖氨酸残基，因此，18F-SFB标记在AnnexinV上的位置是不确定的，甚至标记上的个数也不确定。另外，AnnexinV中的一些赖氨酸残基处在AnnexinV与PS结合的活性区域附近，18F-SFB与该处的赖氨酸残基连接则会影响AnnexinV与PS的亲和性。这些均会导致18F-SFB-AnnexinV在细胞凋亡显像时特异性较低。为实现对AnnexinV的定位标记，且不影响AnnexinV与PS的亲和性，进而提高AnnexinV凋亡显像的特异性，现有技术中出现了对AnnexinV进行修饰，研究新的AnnexinV蛋白变体的相关技术。例如，2008年Li,Xuehe等用18F-FBABM对N端接一个半胱氨酸的AnnexinV蛋白进行标记，研究结果显示，AnnexinV经上述修饰后不影响其与PS结合的亲和力，但是18F-FBABM与蛋白的标记率比较低，仅为37％，无法实现更为高效标记。中国专利文献CN102690345A中公开了一种在大肠杆菌中克隆、表达并纯化得到的新的AnnexinV变体，该变体仅在天然AnnexinV的C-末端添加了1个半胱氨酸(Cys-AnnexinV)，该变体已证实可用于99mTc的标记。
技术实现思路
本专利技术所要解决的第一个技术问题是现有技术中的18F标记AnnexinV的方法无法实现对AnnexinV进行定位标记、标记率低、无法保证AnnexinV与PS较好的亲和性的问题，进而提供一种可实现18F定位标记Cys-AnnexinV的、标记后Cys-AnnexinV与PS保持良好的亲和性的高标记率的18F标记Cys-AnnexinV的方法。本专利技术解决的第二个技术问题是现有技术中的18F标记AnnexinV的PET显像剂特异性较低、无法实现良好的显像效果，进而提供一种特异性高、显像效果良好的18F标记Cys-AnnexinV的PET显像剂。本专利技术的18F标记Cys-AnnexinV的方法，采用18F-FBEM标记Cys-AnnexinV。具体包括以下步骤：取18F-FBEM与Cys-AnnexinV溶解于溶剂中，混合均匀，形成反应液，在30-40℃下反应至生成标记产物18F-FBEM-Cys-AnnexinV。进一步的，本领域技术人员可根据原料的溶解等性质选取溶剂，优选的，所述溶剂为乙醇、水、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液中的一种或多种。进一步的，在所述反应液中，所述18F-FBEM的放射性活度为1-1000MBq/mL。所述Cys-AnnexinV的浓度为0.2-20mg/mL。本专利技术的18F标记Cys-AnnexinV的方法，还包括采用缓冲液调节所述反应液的pH值至5-8的步骤。当然，所述缓冲液只要可以实现将反应液的pH值调节至所需范围内即可，优选的，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液中的一种或两者的混合液。根据上述方法制备得到的标记产物18F-FBEM-Cys-AnnexinV，可应用与PET显像领域。所述的18F-FBEM-Cys-AnnexinV在制备PET显像剂中的应用。本专利技术提供的PET显像剂，包括18F-FBEM-Cys-AnnexinV。本专利技术所述的18F-FBEM，即N-[2-(4-[18F]氟苯甲酰氨基)乙基]马来酰亚胺，其结构式如下：所述Cys-AnnexinV为AnnexinV的变体蛋白，在天然的AnnexinV的C-末端添加1个半胱氨酸，其结构如下：所述18F-FBEM与Cys-AnnexinV的标记反应过程如下所示：本专利技术旨在讨论18F标记Cys-AnnexinV的方法，所用的原料18F-FBEM与Cys-AnnexinV可采用本领域技术人员常规方法得到。例如，所述Cys-AnnexinV可采用中国专利文献CN102690345A中记载的在大肠杆菌中克隆、表达并纯化得到的AnnexinV变体的方法得到。本专利技术的上述技术方案，相比现有技术具有以下优点：(1)本专利技术的18F标记Cys-AnnexinV的方法，采用18F-FBEM标记Cys-AnnexinV。首先，AnnexinV的三维结构显示，其N-端和C-端都位于分子膜结合点的对面，在重组过程中对AnnexinV的两端进行修饰并不影响重组蛋白在Escherichiacolli的表达或折叠，也不改变其与膜PS结合的亲合性，因此，在AnnexinV的C-末端添加1个半胱氨酸得到的Cys-AnnexinV，其与PS结合的亲合性并未受到影响。与此同时，经过修饰得到的Cys-AnnexinV可与18F-FBEM基团实现高选择性的连接。Cys-AnnexinV的C端的游离巯基与18F-FBEM上的双键发生特异性连接，可较好的保证18F的定位标记，避免了标记位置、标记数量的不确定带来的显像特异性低的问题。(2)本专利技术标记方法，步骤简单易行，且标记结果直观准确。经实验表明，本专利技术的标记方法，标记率可达80％以上，且标记产物与反应中可本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种18F标记Cys‑Annexin V的方法，其特征在于，采用18F‑FBEM标记Cys‑Annexin V。
【技术特征摘要】
1.一种18F标记Cys-AnnexinV的方法，其特征在于，采用18F-FBEM标记Cys-AnnexinV，具体包括以下步骤：取18F-FBEM与Cys-AnnexinV溶解于溶剂中，混合均匀，形成反应液，在30-40℃下反应至生成标记产物18F-FBEM-Cys-AnnexinV；在所述反应液中，所述18F-FBEM的放射性活度为1-1000MBq/mL，所述Cys-AnnexinV的浓度为0.2-20mg/mL。2.根据权利要求1所述的18F标记Cys-AnnexinV的方法，其特征在于，所述溶剂为乙醇、水、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液中的一种或多种。...
【专利技术属性】
技术研发人员：陆春雄，蒋泉福，俞惠新，华子春，胡敏进，谭成，
申请(专利权)人：江苏省原子医学研究所，江苏靶标生物医药研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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