本发明专利技术涉及特异性结合EPO的DNA适配体、其制备方法及其用途，具体地提供了能特异性结合EPO的DNA适配体及利用改良的SELEX技术筛选适配体的方法，提供了检测稳定性更好、灵敏度更高且方便、快捷的EPO检测元件。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及蛋白质学、分子生物学以及组合化学领域。具体而言，本专利技术涉及蛋白新型识别元件-DNA适配体(Aptamer)、其制备方法及其用途。
技术介绍
促红细胞生成素(Erythropoietin，ΕΡ0)是一种促进人体红细胞生成的功能性糖蛋白。当人体处于低血氧浓度时，肾脏分泌产生的促红细胞生成素通过激活红祖细胞膜上的促红细胞生成素受体，使之增殖分化成成熟的红细胞，从而调节外周红细胞的数量，因此 EPO是一种强有力的红细胞生成刺激剂(Jelkmann W. Erythropoietin structure, control of production, and function. Physiol Rev,1992,72(2) :449_489)。1985年，人们利用基因重组技术合成生成了重组人促红细胞生成素(rHuEPO)。 目前商品化的rhuEPO主要有四种，rHuEPO- α，rHuEPO- β，新型红细胞生成刺激蛋白 Darb印oetin(商品名Aranesp)和持续性的促红细胞生成素受体激动剂(Continuous ErythropoietinReceptor Activator, CERA)。rHuEPO在临床上主要用于治疗肾性贫血以及肿瘤等各种慢性疾患所伴发的贫血。同时，由于EPO具有可促进红细胞产生，从而增加机体的携氧能力，改善耐受力的特性，因此在人类体育竞技和马术比赛中经常被滥用作兴奋剂以提高比赛成绩。据估计在耐力比赛中，约有3-7%的运动员使用重组EP0(Wilber RL, Detection of DNA-recombinant human epoetin—alpha as apharmacological ergogenic aid. Sports Med, 2002，32 :125-142.)。在2009年的禁用药物清单中，S2项下的第一项以促红细胞生成刺激剂代替促红细胞生成素，以便更清晰的标明近年出现的各类新的EPO类似物(The World Anti-Doping Code-THE 2009 PROHIBITED LISTINTERNATIONAL STANDARD, http: //www. wada-ama. org)。因此如何对EPO进行有效的检测是当前人们关注的热点。在临床检测中，近年发展起来的免疫测定法是目前应用最广泛的EPO检测方法。 免疫测定法以抗原、抗体反应的特异性和亲和性为基础，主要包括放射免疫法、酶免分析法、荧光免疫分析法、化学发光免疫分析法等。在EPO作为兴奋剂的检测方面，2000年以来，国际奥委会使用等电聚焦-免疫双印迹法检测运动员是否注射过重组EPO产品，并将该方法作为人类体育比赛中滥用EPO的标准检测方法，其每条印迹谱带的检出灵敏度为1. 7pg。另外，MALDI-T0F-MS和ESI-MS等各类质谱技术也为rHuEPO的检出提供了灵敏的方法(Guan F et al，Differentiation andldentification of Recombinant Human Erythropoietin andDarbepoetin Alfa in Equine Plasma by LC-MS/MS for Doping Control. Anal. Chem，2008，80(10) :3811-3817)。 2009 年 Guan i果题组在癌症病人血浆中检出 NESP(novel erythropoiesis stimulating protein),最低检出限为 0. Ing/mL(Guan F et al, Identification ofDarbepoetin Alfa in Human Plasma by Liquid ChromatographyCoupled to Mass Spectrometry for Doping Control, Int. J. Sports. Med.，2009 ；30 :80-86.)。综上所述，无论是在EPO的临床检测还是作为兴奋剂的检测中，都是基于免疫抗体捕获富集的技术。但抗体自身对于环境温度和PH变化的敏感性与不耐受性以及产品批间重复性较低等这些局限性均影响免疫分析的稳定性并且阻碍其灵敏度的进一步提高。 且有报道称用于制备EPO单克隆抗体AE 7A5的抗原氨基酸序列中含有的中心四肽在500 多种人体蛋白和185种大肠杆菌蛋白中广泛存在，因此导致抗体AE7A5会与真核生物、菌类蛋白和哺乳动物组织，例如膀胱上皮组织产生明显的交叉反应(Franke W W等，errors and risks of false-positiveresults in urinary EPO drug tests. Clinica Chimica Acta. 2006,373 :189-190.)。因此，亟需高稳定性、高灵敏度、低交叉反应且方便、快捷的 EPO检测元件和检测方法的开发。适配体的概念在1990年由Tuerk等首次提出，是指利用指数富集的配体进化技术 (systematic evolution of ligands by exponentialenrichment，SELEX)从特定的寡核苷酸库中筛选出对目标靶有特异性相互作用的寡核苷酸(DNA或RNA)。适配体与靶分子之间分子识别功能与抗体极为相似，但与传统的抗体相比，适配体具有以下特点和优势(1)对目标靶分子具有与抗体相当甚至更高的亲和性；( 可以大量、快速的在体外合成，制备方法更为简单快捷；C3)可以针对不同种类的目标靶进行筛选，包括生物毒性的分子以及只具有半抗原性的分子，拓宽了其应用范围；(4)稳定性优于抗体，利于储存；(5)易功能化修饰与标记。基于适配体的上述优良特性，其在疾病检测、药物研发、临床治疗、分析化学、蛋白质组学以及基因表达调控机理研究等多个领域都有着良好的应用前景。但是目前国内外尚无采用SELEX技术针对rHuEPO-α筛选特异性寡核苷酸适配体的研究工作。
技术实现思路
为此，专利技术人鉴于EPO分子的结构特点，设计了改良的亲和树脂筛选策略，借助基于SELEX技术的组合化学技术，筛选得到能特异性结合EPO的DNA适配体。该适配体是除抗体以外的新的EPO结合剂，可以特异性捕获和富集血浆和尿液中EPO分子，并且相对于抗体具有稳定、方便、快捷的优势。其中，本
技术实现思路
中所提到的EPO蛋白，均指天然EPO蛋白、 rHuEPO- α蛋白和rHuEPO-β蛋白中的一种或多种，还包括去糖基化的上述EPO蛋白，特别说明的除外。同时，专利技术人利用寡阴离子型适配体和特定金属阳离子间的静电作用，通过改变特定的离子浓度，能够有效地筛选得到结合性良好的DNA适配体，由此提供了新的DNA适配体的筛选方法。具体地，本专利技术提供了1.特异性结合EPO蛋白的适配体及其片段，其选自SEQ ID NO 1 120所示的序列中的一个或者多个，其中，SEQ ID NO :61-120在结构上均符合下述通式I所示的结构特征，5，-C TTCTGCCCGCCTCCTTCC-N39-GGAGACGAGATAGGCGGACACT-3'(通式 I)。通式 I 中 N代表碱基A、G、C、本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．特异性结合ＥＰＯ蛋白的适配体，其选自ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１２０所示的序列中的一个或者多个。
【技术特征摘要】
1.特异性结合EPO蛋白的适配体，其选自SEQID NO :1 120所示的序列中的一个或者多个。2.根据权利要求1所述的适配体，其选自SEQID NO :53、56、60、113、116和120所示的序列。3.根据权利要求1-2所述的任一项适配体，其被能够增强其半衰期、提高其稳定性、防止核酸内切酶或者外切酶切割的化合物所修饰。4.用于EPO蛋白检测的组合物、试剂盒和芯片，其中含有权利要求1-3中任一项的适配体。5.根据权利要求4所述的适配体，其中的EPO蛋白选自天然EPO蛋白、rHuEPO-α蛋白、rHuEPO- β蛋白和去糖基化的上述EPO蛋白中的一种或多种。6.权利要求1-3中任一项的适配体用于EPO蛋白检测的用途。7.根据权利要求6所述的适配体，其中的EPO蛋白选自天然EPO蛋白、rHuEPO-α蛋白、rHuEPO- β蛋白和去糖基化的上述EPO蛋白中的一种或多种。8.筛选特异性结合EPO蛋白的适配体的方法，包括步骤(a)-(l)(a)提供下述(i)-(iv)(i)筛选文库ssDNA文库；(ii)靶蛋白ΕΡ0蛋白，其中的EPO蛋白选自天然EPO蛋白、rHUEPO-α蛋白、rHUEPO-β 蛋白和去糖基化的上述EPO蛋白中的一种或多种，优选rHUEPO-α蛋白；(iii)亲和树脂偶联有对EPO有特异性亲和力的物质的树脂，优选偶联有麦胚凝集素的琼脂糖树脂；和(iv)偶联有EPO的亲和树脂(iii)；(b)使步骤(a)中的筛选文库和亲和树脂(iii)在适宜的条件下接触， 所述接触可以包括温育、洗涤，所述“适宜的条件”是指足以使筛选文库中的成员能够和亲和树脂特异性结合的结合的条件，该条件可以涉及温度、作用时间、结合缓冲液的成分、PH值； 然后收集未与亲和树脂(iii)结合的ssDNA文库；...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢剑炜，张朝阳，郭磊，唐吉军，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所，
类型：发明
国别省市：11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。