一种胸腺肽β4的分离纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种胸腺肽β4的分离纯化方法，包括：将动物胸腺置于高氯酸溶液中破碎，离心取上清液，调节pH后再次离心取上清液，第一次冻干；将第一冻干粉溶于pH值小于胸腺肽β4等电点的第一缓冲液，通过装填有阳离子交换剂的交换柱，第一次洗脱，收集洗脱液，第二次冻干，将第二冻干粉溶于pH值大于胸腺肽β4等电点的缓冲液中，通过装填有阴离子交换剂的交换柱，第二次洗脱，收集洗脱液，脱盐。本发明专利技术将样品置于高氯酸溶液中破碎离心，上清液经阳离子交换色谱和阴离子交换剂色谱纯化，得率高，要求设备简单，适用于工业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术生物工程
，尤其涉及一种胸腺肽β4的分离纯化方法。
技术介绍
胸腺肽是胸腺分泌的具有生物活性的多肽的混和物，是一种免疫增强剂。在机体的免疫系统、神经内分泌系统、生殖系统中起到重要的调节作用。它能够改善机体的免疫状态，协调内分泌，提高机体对细菌病毒感染的抵抗力。胸腺肽已经用于多种疾病的辅助治疗，疗效显著，在饲料中添加亦能起到促生长作用。胸腺肽含有的多种多肽均具有一定的药效，其中一些已经用于疾病的治疗。如日达仙是Sci Clone公司生产的胸腺肽α1，临床用于慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎以及恶性肿瘤等的治疗。胸腺肽β4是从胸腺素5和5A中分离得到的，是胸腺肽β家族中的一员。尽管胸腺肽β4是从胸腺中分离得到的，但在机体众多组织中均有它的踪迹，在参与调节细胞及生理活动等一系列过程中呈现出功能的多样性，因此自它诞生时起，就引起了生物医学工作者的广泛关注。胸腺肽β4是由43个氨基酸残基组成的多肽，分子量4963，等电点为pH 5.1，在哺乳动物中高度保守。与胸腺肽α原或类胸腺肽不同，胸腺肽β4是胞浆蛋白而非核蛋白。并且它只含有较少的疏水性氨基酸，不含有Lys-Lys-Xaa-Lys结构区域。化学构象研究表明，胸腺肽β4是以单链形式存在及发挥作用的，其第31～43残基和第18～30残基间是一内部重复区域，有6个氨基酸相同。虽然存在第4～12残基和第32～40残基两个α螺旋区，但是胸腺肽β4没有β转角形成。研究表明，胸腺肽β4可以促进创伤的愈合，特别是对于眼角膜受伤有良好的疗效。用胸腺肽β4治疗创伤是目前国内外研究的热点。研究表明，与生长因子的作用机理不同，胸腺肽β4不能促进细胞的生长。胸腺肽β4通过促进血管生长和细胞的迁移对创伤的愈合起作用，不仅对正常细胞起作用，且对年老的细胞起作用，因此在创伤愈合方面具有独特的优势。同时，研究表明胸腺肽β4还可以促进头发的再生，其作用机理与促进创伤的愈合相似。T淋巴细胞在抗肿瘤过程中起到关键性作用。在肿瘤的发生、扩散和转移过程中，免疫功能特别是细胞免疫功能降低是其重要因素。在机体肿瘤状态下，T细胞功能不全和抑制表现为其数量减少和功能改变以及T细胞亚群比例失调。胸腺肽对于胸腺依赖性T淋巴细胞的成熟和分化起着关键性作用，故可增强肿瘤化疗患者细胞免疫能力，起到辅助治疗的作用。最新的研究表明胸腺肽β4基因的表达水平与癌细胞转移呈正相关，与肿瘤凋亡关系密切。因此，可通过对胸腺肽β4表达水平的监测定位癌细胞，也可进一步研究通过改变胸腺肽β4的表达能否抑制肿瘤的生长。目前，对于胸腺肽β4(Thymosin β4，Tβ4)分离纯化的报道多见于国外文献，国内对于此方面的研究较少，更多是集中于Tβ4生理功能和医疗功效方面的研究。对于Tβ4分离纯化的研究，国外所用方法包括了近年来广泛用于生化分离的超滤、层析、等点聚焦、-->高效液相色谱等技术。如：A.Roboti、E.Livaniou等采用色谱聚焦的方法，一次分离得到120mg Tβ4；Ewald Hannappel，Friederike Wartenberg等采用等电聚焦和制备高效液相的方法，分离得到了Tβ4和Tβ9；Mahnaz Badamchian等采用制备高效液相进行Tβ4的分离纯化；Allan L.Goldstein等分别采用阴离子或阳离子交换柱进行梯度洗脱，分离纯化得到Tβ3和Tβ4并确定了两者的结构。上述所用方法，多数采用等电聚焦或高效液相方法，虽然上述方法获得产品纯度较高，但成本高、制备量小，同时对设备要求很高，不适合工业化生产。采用一步离子交换法虽然方法简单，成本低，但产品的纯度达不到医药应用的要求。
技术实现思路
本专利技术提供了一种阴阳离子色谱串联分离纯化胸腺肽β4的方法，解决了传统方法设备要求高、不适合工业化生产的问题。一种胸腺肽β4的分离纯化方法，包括：将动物胸腺置于高氯酸溶液中破碎，离心取上清液，调节pH后再次离心取上清液，第一次冻干；将第一冻干粉溶于pH值小于胸腺肽β4等电点的第一缓冲液，通过装填有阳离子交换剂的交换柱，第一次洗脱，收集洗脱液，第二次冻干，将第二冻干粉溶于pH值大于胸腺肽β4等电点的缓冲液中，通过装填有阴离子交换剂的交换柱，第二次洗脱，收集洗脱液，脱盐。所述的动物胸腺优选为家畜胸腺，所述的上清液pH调节至2.0～5.0。所述的高氯酸溶液的浓度优选为0.2～1M，最优选为0.41M。所述的阳离子交换剂优选为美国GE healthcare公司的CM-sepharoseFastFlow(FF)凝胶，更优选的，装填有阳离子交换剂的交换柱的长度为30cm，上样液通过速率为40cm/h。所述的阴离子交换剂优选为美国GE healthcare公司的DEAE-sepharose FastFlow(FF)凝胶，更优选的，第二冻干粉的浓度为6g/L、上样液通过速率60cm/h，装填有DEAE-sepharose FF凝胶的交换柱长度40cm。所述的第一次洗脱，收集洗脱液包括：分别用质量体积浓度为1％、4％的NaCl溶液阶跃洗脱，收集利用质量体积浓度4％的NaCl溶液洗脱获得的洗脱液。所述的第二次洗脱，收集洗脱液包括：分别用蒸馏水、质量体积浓度为1％、4％和5％的NaCl溶液阶跃洗脱，收集利用质量体积浓度4％的NaCl溶液洗脱获得的洗脱液。所述的第一缓冲液优选为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，pH值为2.5～4.5所述的第二缓冲液优选为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，pH值为6.5-7.1。所述的脱盐方法优选为凝胶过滤。本专利技术将样品置于高氯酸溶液中破碎离心，上清液经阳离子交换色谱和阴离子交换剂色谱纯化，得率高，要求设备简单，适用于工业化生产。附图说明图1为实施例2阳离子交换色谱洗脱曲线；图2为实施例3阴离子交换色谱洗脱曲线；图3为实施例3纯化得到的胸腺β4聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱；-->图4为实施例3纯化得到的胸腺β4高效液相色谱图；图5为实施例5流出液中蛋白含量与流速关系曲线图；图6为实施例5流速为100cm/h下柱长与流出液中蛋白含量以及柱压的关系曲线图；图7为实施例5流速为40cm/h下柱长与流出液中蛋白含量以及柱压的关系曲线图；图8为实施例5梯度洗脱曲线；图9为实施例7洗脱液凝胶过滤后滤液吸光度及电导率检测图谱。具体实施方式实施例1提取胸腺五肽(TF5)称取新鲜的小牛胸腺(杭州四季青生物工程材料有限公司)，按照1：5(g/ml)的比例加入到事先配好的0.41mol/l的高氯酸溶液中，倒入组织匀浆器进行匀浆。将匀浆液在4℃、10000r/min的条件下离心20min，取上清液加入10mol/l的KOH水溶液调节pH＝3.0。将调好的溶液在4℃、10000r/min的条件下离心10min，取上清液。实施例2阳离子交换色谱将上清液放在-20℃冷冻，放入冷冻干燥机中冷冻干燥。冻干粉以5g/L溶于0.02mol/L、pH4.20的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，配成上样液。阳离子交换采用CM-sepharose FF凝胶(GE Healthcare，USA)，填装后柱高为50cm，直径为2.5cm。上样液以5BV/h的速度通过阳离子交换柱，上样量为1L，交换之后用1％、4％的NaCl溶液(w/v)以本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种胸腺肽β４的分离纯化方法，包括：将动物胸腺置于高氯酸溶液中破碎，离心取上清液，调节ｐＨ后再次离心取上清液，第一次冻干；将第一冻干粉溶于ｐＨ值小于胸腺肽β４等电点的第一缓冲液，通过装填有阳离子交换剂的交换柱，第一次洗脱，收集洗脱液，第二次冻干，将第二冻干粉溶于ｐＨ值大于胸腺肽β４等电点的缓冲液中，通过装填有阴离子交换剂的交换柱，第二次洗脱，收集洗脱液，脱盐。

【技术特征摘要】
1.一种胸腺肽β4的分离纯化方法，包括：将动物胸腺置于高氯酸溶液中破碎，离心取上清液，调节pH后再次离心取上清液，第一次冻干；将第一冻干粉溶于pH值小于胸腺肽β4等电点的第一缓冲液，通过装填有阳离子交换剂的交换柱，第一次洗脱，收集洗脱液，第二次冻干，将第二冻干粉溶于pH值大于胸腺肽β4等电点的缓冲液中，通过装填有阴离子交换剂的交换柱，第二次洗脱，收集洗脱液，脱盐。2.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，所述的高氯酸溶液浓度为0.2～1M。3.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，所述的阳离子交换剂为CM-sepharose FastFlow凝胶。4.根据权利要求3所述的分离纯化方法，其特征在于，所述的第一次洗脱，收集洗脱液包括：分别用质量体积浓度为1％、4％的NaCl溶液阶跃洗...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴绵斌，张书衍，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86