毒蜥外泌肽融合蛋白制造技术

本发明专利技术提供包含经多肽连接子与运铁蛋白(Tf)融合的毒蜥外泌肽 -4的融合蛋白，和相应的核酸分子，载体，宿主细胞和药物组合物。本 发明专利技术还提供毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白用于治疗II型糖尿病，肥胖和减 轻体重的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及包含毒蜥外泌肽-4 ( exendin-4 )和运铁蛋白的融合蛋 白和其用于治疗与升高的葡萄糖血清水平相关的疾病和减轻体重的用途，所述疾病例如II型糖尿病。本专利技术的融合蛋白还可以用于治疗其 他已知受益于用毒蜥外泌肽-4和其他GLP-1受体激动剂治疗的疾病， 例如I型糖尿病，充血性心力衰竭，心肌梗死，肠易激综合征，神经 系统疾病，例如阿尔茨海默病(Alzheimer， s disease)和亨廷顿病 (Huntington' s disease),以及非酒精、非脂肪肝肝病。
技术介绍
糖尿病指来源于多种病因因素并且由升高的血浆葡萄糖水平或禁 食期间的或口服葡萄糖耐受测试期间施用葡萄糖后的高血糖表征的疾 病过程。通常，存在两种公认的糖尿病形式。对于I型糖尿病，或胰 岛素依赖型糖尿病(IDDM)，患者产生很少的胰岛素或不产生胰岛素 (胰岛素是调节葡萄糖利用的激素)。对于II型糖尿病，或非胰岛素 依赖型糖尿病(NIDDM)，患者通常具有与非糖尿病受试者相比相同或 甚至更高的血浆胰岛素水平。但是，这些患者在主要的胰岛素敏感组 织中对胰岛素对葡萄糖和类脂代谢的刺激效应产生了抗性，所述主要 的胰岛素敏感组织为肌肉，肝和脂肪组织。血浆胰岛素水平虽然升高 但也不足以克服显著的胰岛素抗性，导致高血糖。持续的或不受控制的高血糖与增加的和提早(premature )的发病 率和死亡率相关。通常，不正常的葡萄糖体内平衡直接和间接地与脂， 脂蛋白和栽脂蛋白代谢及其他代谢的改变和血流动力学疾病相关。例 如，患有II型糖尿病的患者具有显著增加的患大血管和微血管并发症 的风险，包括冠心病，中风，外周血管疾病，高血压，肾病和神经疾5病o通常由与总身体脂肪相关且作为某些疾病风险的测量标准的体重指数(BMI)，定义肥胖和超重。BMI通过以千克为单位的体重除以以 米为单位的身高的平方进行计算(kg/m2)。通常，超重定义为25-29.9 kg/瓜2的BMI，肥胖定义为30kg/m2或更高的BMI。参见，例如，National Heart, Lung, and Blood Institute, Clinical Guidelines on the Identification, Evaluation, and Treatment of Overweight and Obesity in Adults, The Evidence Report, Washington, DC: U.S. Department of Health and Human Services, NIH publication no. 98-4083 (1998)。超重或肥胖的个体具有增加的患小病的风险，例如高血压，血脂 异常，II型(非胰岛素依赖型)糖尿病，胰岛素抗性，葡萄糖不耐性， 高胰岛素血症，冠心病，心绞痛，充血性心力衰竭，中风，胆结石， 胆嚢炎，胆石病，痛风，骨关节炎，阻塞性睡眠呼吸暂停和呼吸问题， 胆嚢疾病，某些形式的癌症(例如，子宫内膜癌，乳腺癌，前列腺癌， 和结肠癌)和心理障碍(例如忧郁症，进食障碍，扭曲的身体意象 (distorted body image)和低自尊)。肥胖的负面健康结果使其在 美国成为可预防性死亡的第二主因并且在社会上显现出显著的经'济和 社会心理的影响。参见McGinnisM， Foege WH. ， Actual Causes of Death in the United States, /細270: 2207-12， 1993。现在，公认肥胖是一种需要治疗以减少其相关的健康风险的慢性 疾病。虽然减少体重是重要的治疗成果，但肥胖控制的主要目的之一 是改善心血管和代谢值，以减少肥胖相关的发病率和死亡率。已经表 明减少5-10%的体重可以充分地改善代谢值，例如血糖、血压和脂质 浓度。因此，相信体重减少5-10%可以降低发病率和死亡率。目前用 于控制肥胖的可获得的处方药通常通过减少饮食脂肪的吸收，如奥利 司他，或通过借助减少摄食和/或增加能量消耗引起能量亏损，如西布 曲明，来减少体重。目前II型糖尿病的治疗包括施用外源性胰岛素，口服药物和饮食疗法和运动养生法。2QQ5年，依泽那太(exenatide)(毒蜥外泌肽一； Byetta⑧)被FDA批准为用于服用二甲双胍和/或磺酰脲，但没有达到 足够的升胰乌素(glycemic)控制的II型糖尿病患者的辅助治疗。依 泽那太是毒蜥外泌肽-4， 一种有效的GLP-1受体激动剂，其是毒蜥唾 液腺的内源性产物。像GLP-1，毒蜥外泌肽-4是一种肠降血糖素。其 是促胰岛素性的，抑制摄食和胃排空，并且对啮齿动物的P细胞是营 养性的(trophic) (Parks等，Metabolism. 50: 583-589， 2001; Aziz and Anderson, J. Nutr. 132: 990-995, 2002;和Egan等，J. Clin. Endocrinol. Metab. 87: 1282-1290， 2002)。此外，由于其N-末端 第2位存在甘氨酸，毒蜥外泌肽-4如GLP-1 —样不是DPPIV的底物。 使用依泽那太的弊端在于每天必须注射两次，因为它的~2仅有2-4 小时(Kolterman等，J. Clin. Endocrinol. Metab. 88: 3082-3089， 2003和Fineman等，Diabetes Care. 26: 2370—2377, 2003)。因此，需要维持更久的，抵抗降解的GLP-1受体激动剂分子，其 可以用作治疗剂提供升胰岛素控制以及减少体重。开发长效肠降血糖 素模拟物提供了通过葡萄糖依赖性胰岛素分泌的持续增强来增强升胰 岛素控制的能力，且提供了较不频繁给药的便利。本专利技术通过提供与 经修饰的运铁蛋白融合的毒晰外泌肽-4分子实现这一需要，真延长了 毒蜥外泌肽-4的体内循环半衰期，同时保持了生物活性。因此，本发 明的融合蛋白的使用可以降低通常与肠降血糖素使用相关的恶心和呕 吐的高发。专利技术概迷本专利技术提供了融合蛋白，其包含通过肽连接子(linker)，优选 通过非螺旋的多肽连接子与运铁蛋白(Tf )分子融合的毒蜥外泌肽-4。优选地，连接子选自PEAPTD (SEQ ID NO: 6)， (PEAPTD)2 (SEQ ID NO: 5)，与IgG铰链连接子结合的PEAPTD (SEQ ID NO: 6)，以及与 IgG铰链连接子结合的(PEAPTD)2 (SEQ ID NO: 6)。更优选地，连接 子是(PEAPTD) 2 (SEQ ID NO: 5)。7本专利技术融合蛋白的Tf部分可来源于任意的哺乳动物Tf，优选地， 来源于人Tf。更优选地，Tf是经修饰的Tf (mTf )以表现出与天然运 铁蛋白分子相比减少的糖基化，并且甚至更优选地，Tf具有如SEQID N0: 17所示的氨基酸序列。在其他的优选的实施方案中，修饰Tf以 减少铁结合和/或与Tf受体的结合。在另一个优选的实施方案中，融合蛋白的N-末端进一步包含分泌 信号序列，优选地，信号序列来自血清运铁蛋白，乳铁蛋白，黑素运 铁蛋白(melanotransferrin)，或其变本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种融合蛋白，其包含经多肽连接子与运铁蛋白（Ｔｆ）融合的毒蜥外泌肽－４。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2006.7.24 US 60/832,582;2006.11.8 US 60/857,474;201. 一种融合蛋白，其包含经多肽连接子与运铁蛋白(Tf)融合的毒蜥外泌肽-4。2. 权利要求1的融合蛋白，其中所述连接子是非螺旋多肽。3. 权利要求1的融合蛋白，其中所述连接子选自PEAPTD (SEQ ID NO: 6)， (PEAPTD) 2 (SEQ ID NO: 5)，与IgG铰链连接子结合的PEAPTD (SEQIDNO: 6),和与IgG铰链连接子结合的(PEAPTD) 2 (SEQ ID NO: 5)。4. 权利要求1的融合蛋白，其中所述的毒蜥外泌肽-4具有如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列。5. 权利要求l的融合蛋白，其中所述的Tf经修饰以表现出与天 然运铁蛋白分子相比减少的糖基化。6. 权利要求5的融合蛋白，其中所述的Tf具有如SEQ ID NO: 17 所示的氨基酸序列。7. 权利要求1的融合蛋白，其中毒蜥外泌肽-4分子在融合蛋白 的N-末端，融合蛋白的C-末端或融合蛋白的N-末端和C-末端处融合。8. 权利要求1的融合蛋白，其中融合蛋白的N-末端进一步包含 分泌信号序列。9. 权利要求8的融合蛋白，其中所述信号序列是来自血清运铁蛋 白，乳铁蛋白，黑素运铁蛋白，或其变体的信号序列。10. 权利要求8的融合蛋白，其中所述信号序列是人血清白蛋白 (HSA)/MFoc-1杂合前导序列，经修饰的HSA/MFot-1杂合前导序列，或 Tf信号序列。11. 权利要求8的融合蛋白，其中所述信号序列是如SEQ ID NO: 18 所示的人Tf信号序列。12. 编码权利要求l-ll中任一项的融合蛋白的核酸。13. 包含权利要求12的核酸的载体。14. 包含权利要求13的载体的宿主细胞。15. —种融合蛋白，其包含与经修饰的运铁蛋白(mTf )融合的毒蜥外泌肽-4，其中所迷的融合蛋白包含如SEQ ID NO: 23所示的氨基酸 序列。16. —种融合蛋白，其包含与mT...

【专利技术属性】
技术研发人员：H·萨迪吉，C·P·普赖尔，D·J·巴兰斯，A·J·特纳，
申请(专利权)人：比奥雷克西斯制药公司，
类型：发明
国别省市：US