单克隆抗体Fab’-平阳霉素偶联物及其抗肿瘤作用制造技术

抗人肝癌ＢＥＬ－７４０２细胞单克隆抗体３Ａ５，以适当方法获得其活性Ｆａｂ’片段；以葡聚糖Ｔ－４０作中介体，将Ｆａｂ’与平阳霉素相偶联，体外实验用培养的人体肝癌ＢＥＬ－７４０２细胞和口腔鳞癌ＫＢ细胞，克隆形成法检测，偶联物对二者有杀伤作用，抑制５０％克隆形成的浓度分别为０．０２μｍｏｌ／Ｌ和０．５μｍｏｌ／Ｌ，体内实验用结肠癌２６，取结肠癌２６瘤组织加生理盐水匀浆接种于Ｂａｌｂ／Ｃ小鼠腋窝皮下，２４小时后给药，抑瘤率分别为７７％（ｉｐ５ｍｇ／ｋｇ×６，两天一次）和８９％（ｉｖ５ｍｇ／ｋｇ×７，两天一次）或９１％（ｉｖ１０ｍｇ／ｋｇ×７，两天一次），同时动物存活时间明显延长，其效果优于等剂量游离平阳霉素，为单克隆抗体Ｆａｂ’与平阳霉素偶联物用于治疗肿瘤提供了依据。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及以一种单克隆抗体作为载体，偶联携带抗肿瘤药物进行抗肿瘤治的方法。单克隆抗体(单抗)3A5是以人肝癌BEL-7402细胞免疫LOU/C大鼠后取其脾细胞与大鼠骨髓瘤IR983F细胞融合，经筛选，克隆后所得杂交瘤细胞株分泌的抗体。据报道，小鼠单克隆抗体Fab’片段有较完整抗体更强的组织穿透力，易于到达肿瘤组织深部(Cancer Research 1991，516363)，有利于肿瘤诊疗。但大鼠单抗未见相似报道。以胃蛋白酶消化大鼠不同类型单抗，可获得单抗F(ab)’2片段，但其免疫学活性和Fab’片段的制备方法及其与药物偶联物的研究(Journal of Immunologic methods 1983，64141)均未见报道。有报道认为，单抗3A5与多种肿瘤细胞有强免疫反应性，其与平阳霉素偶联物体外对肝癌BEL-7402细胞具有选择性杀伤作用(中华微生物与免疫学杂志1991；11230)。动物实验表明该偶联物腔内给药可明显延长动物生存时间(药学学报1997；32669)，但未见3A5活性片段与平阳霉素偶联物的报道。抗人肺癌单抗3D3与平阳霉素以分子比1∶68相偶联后在体外对人肺腺癌细胞的杀伤作用比游离平阳霉素强5倍，但未见动物实验的报道(中国肿瘤临床1996；23437)。3A5以木瓜蛋白酶降解可获得Fab片段(药学学报1993；28260)其与平阳霉素偶联物及Fab’的制备则未见报道。综上所述，迄今为止，大鼠单抗Fab’片段的制备及其与平阳霉素偶联物的研究国内外均无报道。本项专利技术的研究表明，以适当的方法可以获得有活性的单抗Fab’片断，其与平阳霉素偶联物对实验动物肿瘤有显著疗效，有可能成为一种新的肿瘤治疗药物。本专利技术的目的是以合适的方法制备单抗3A5Fab’片段，并将此片断与平阳霉素相偶联，用于临床治疗肿瘤。本项专利技术的内容与要点是1.单抗3A5Fab’的制备 单抗3A5用0.2mol/L的柠檬酸缓冲液调整为1-2mg/ml，pH3.7.加入适量胃蛋白酶，37℃反应6小时，产物经SephadexG-150层析纯化获得F(ab)’2。6-10mg/ml在pH7.5时可经5mmol/L二巯基苏糖醇(DTT)还原，产物经DE-52阴离子交换层析得Fab’，其分子量约55Kd，其结构包含Fab与部分铰链区。经酶联免疫吸附测定(ELISA)，保持了对人肝癌BEL-7402细胞的免疫反应性(图1)。小鼠抗IV型胶原酶单抗3D6，以无花果蛋白酶消化产生F(ab)’2，经β-巯基乙醇还原获得Fab’，也保持了对IV胶原酶的免疫反应性(图2)。2.Fab’与平阳霉素偶联物制备 将葡聚糖T-40(Dextran T-40)以高碘酸钠氧化，透析，冷冻干燥，得多醛基葡聚糖(PAD)。按重量比1∶2取PAD与平阳霉素共溶于适量磷酸盐缓冲液(PBS)中，4℃避光反应12小时后，加入与PAD等摩尔数的Fab’，继续反应12小时。以适量硼氢化钠还原2小时。产物经Sephadex G-100层析纯化，收集既有抗体活性又有抑菌活性部分，即为偶联物。3.偶联物对细胞的杀伤作用 体外培的人体肝癌细胞BEL-7402和口腔鳞癌KB细胞，用克隆形成法测定，药物作用1小时。结果平阳霉素对两种细胞均有杀伤作用，抑制50％克隆形成的浓度(IC50)分别为0.51μmol/L和0.47μmol/L；偶联物对两种细胞IC50分别为0.02μmol/L和0.50μmol/L。表明偶联物对BEL-7402细胞具有一定选择性杀伤作用(图3，图4)。4.偶联物腹腔注射对小鼠结肠癌的疗效 取结肠癌26瘤组织，按1∶3加入生理盐水研磨成匀浆，按0.2ml/只接种子BALB/c小鼠腋窝皮下；接种24小时后经腹腔内注射(ip)给药，对照组给予生理盐水，14天后处死动物，取肿瘤称重，计算抑瘤率。结果表明，平阳霉素和偶联物对结肠癌26均有疗效，抑瘤率分别为56％和77％，二者有显著差异(表1)。表1偶联物腹腔内注射对小鼠结肠癌26的抑制作用剂量 动物数 体重(g) 瘤重(g)抑瘤率(mg/kg×次数) 开始/结束开始/结束 x±SD (％)对照 10/10 18.8/21.71.59±0.35平阳霉素5×6 10/10 18.8/20.30.71±0.4l 56*偶联物 5×6 10/10 18.9/20.20.37±0.07 77*△皮下接种肿瘤，腹腔给药，两天一次；* P＜0.01与对照比较△△P＜0.01与平阳霉素组比较5.偶联物静脉注射给药(iv)对小鼠结肠癌26的疗效 接种方法同前所述，给药方式为静脉注射。动物不处死，每3天记录体重和测瘤体积，按瘤重(mg)＝l/2长径×短径2计算瘤重，绘制肿瘤生长曲线并观察动物生存时间。研究结果表明，偶联物静脉注射给药对肠癌26有显著疗效，其抑瘤率分别为89％(5mg/Kg)和91％(10mg/Kg)；而游离平阳霉素在相同剂量时抑瘤率分别为70％和79％。偶联物也可显著延长动物存活时间(表2，表3)。表2 偶联物静脉注射对小鼠结肠癌26的抑制作用剂量动物数体重(g)瘤重(g)抑瘤率(mg/kg×次数) 开始/结束 开始/结束x±SD (％)对照 10/1021.6/22.8 0.77±0.22平阳霉素 5×710/1020.9/20.4 0.23±0.09 70*10×710/1021.1/19.3 0.16±0.34 79*偶联物 5×710/1020.9/20.3 0.09±0.02 89*△10×710/1021.4/20.4 0.07±0.02 91*△△皮下接种肿瘤，静脉给药，两天一次；* P＜0.01与对照比较△ P＜0.01与平阳霉素5mg/kg组比较△△P＜0.01与平阳霉素10mg/kg组比较表3 静脉注射给药动物生存情况剂量 动物数 生存期中位数 生存期中位数(mg/kg×次数) (只) (天) 增加百分数(％)对照 1017平阳霉素 5×710297110×7103394偶联物 5×710307610×71038 1246.偶联物毒性 偶联物与平阳霉素腹腔注射给药(5mg/kg×6)对小鼠结肠癌抑瘤率分别为56％和77％，经病理组织学检查，心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠及股骨均未见毒性病变。本专利技术的优点与积极效果是确定了大鼠单抗Fab’制备方法并为单抗与平阳霉素偶联物用于治疗肿瘤提供了必要的依据。平阳霉素已在临床应用多年，有较好疗效，而其与单抗Fab’偶联物对实验动物肿瘤具有明显优于等剂量游离平阳霉素的疗效，预计将可能用于临床肿瘤治疗，并取得良好的效果。 附图说明图1单抗3A5Fab’对BEL-7402细胞免疫反应性其中横坐标为抗体浓度纵坐标为490吸光值1为3A52为3A5Fab’图2单抗3D6Fab’对IV胶原酶的免疫反应性其中横坐标为抗体浓度纵坐标为490吸光值1为3D62为3D6Fab’图3平阳霉素及偶联物对BEL-7402细胞的杀伤作用其中横坐标为药物浓度(umol/l)纵坐标为克隆形成率(％)1为平阳霉素2为偶联物图4平阳霉素及偶联物对KB本文档来自技高网...

【技术保护点】
单克隆抗体Ｆａｂ′－平阳霉素偶联物及其抗肿瘤作用，其特征是所说的抗肿瘤作用的实施包括以下步骤： Ａ．单克隆抗体３Ａ５Ｆａｂ′活性片段的制备； Ｂ．３Ａ５Ｆａｂ′－平阳霉素偶联物的制备 Ｃ．３Ａ５Ｆａｂ′－平阳霉素偶联物的抗肿瘤作用的检测。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：甄永苏，刘小云，王维刚，刘秀均，
申请(专利权)人：中国医学科学院医药生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]